Что не так с тканеинженерной трахеей Маккиарини

Ссылка на обсуждаемую статью https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(11)61715-7/fulltext

В качестве мысленного эксперимента я представила, что я - человек, которому по условному Приоритет 2020 надо срочно сделать хоть какой-то продукт для обеспечения технологического лидерства и всех остальных модных словечек. И мне принесли эту работу, сказав, что там в Швеции уже вовсю пересаживают искусственные органы, надо тоже самое сделать у нас, это точно будет прорыв. После моего неудачного опыта с отрицательными результатами из-за явной недобросовестности авторов, на основании работ которых я планировала эксперименты, всё, что касается моих будущих проектов, я препарирую с особой тщательностью и a priori считаю, что "все лгут". Так что это немного оправдает мою предвзятость по отношению к статье.

Итак, поехали.

Во-первых, это case report, то есть исследование на одном пациенте. Даже если бы у меня не возникло вопросов к дизайну и результатам, бросаться в работу с пациентами я бы точно не стала, а для начала протестировала методику на животных. В статье есть ссылка на эксперименты группы Маккиарини с пересадкой трахеи свиньям, но там и материал другой (децеллюляризованный хрящ, а не синтетический скаффолд) и клетки другие (мезенхимальные стволовые клетки (МСК) с эпителием, а не мононуклеары крови), так что ссылок на нормально проведённую доклинику считай нет. 

Во-вторых, обращает на себя внимание отсутствие in vitro тестов тканеинженерной трахеи в этой статье и ссылок на них в более ранних работах. Например, можно было бы поставить простенькую цитотоксичность, оценить живут ли и делятся клетки на ней, посмотреть, активируются или нет иммунные клетки в культуре. В общем, всё то, что положено делать до того как вшивать что-то в животных, не то что в человека. Даже уже годами известные материалы типа коллагена сначала тестируются на клеточных культурах, затем на животных и только потом зашиваются в людей. Без этих тестов мы рискуем получить отторжение материала.

Кстати, по опыту, в Каролинском институте очень сложно сделать какие-то тяжёлые эксперименты на животных, да и в целом допуск ещё не у каждого есть. Видимо, до пациентов добраться оказалось проще. Возможно, из-за халатности этической комиссии Каролинский институт долго не признавал ошибки Маккиарини, так как это означало признать и их вину.

В-третьих, выбор мононуклеаров для заселения скаффолда мне не совсем понятен. Если данные об их дифференцировке в эпительные клетки есть, то хрящ трахеи они сами уже не образуют (или не показано). Использованные ранее группой Маккиарини МСК и эпителий кажутся более логичным с точки зрения инженерии органа, поскольку в теории они могут образовать нужные ткани на синтетическом скаффолде. Вы можете мне возразить, что возможно, в эксперименте планировалось, что собственные клетки пациента придут и заселят искусственную трахею. Но учитывая огромный размер повреждения, они не образуют там ничего кроме фиброза (а судя по расследованиям так оно случалось), это раз. И нахрена тогда вообще вся эта свистопляска с мононуклеарами, лучше уж тогда по классике факторы роста туда запихнуть, это два.

Также странным кажется анализ содержания мезенхимных клеток на скаффолде по CD105. Этот маркер присутствует на гемопоэтических стволовых клетках (ГСК) и его наличие среди выделенных мононуклеаров вообще не говорит о наличии МСК. Всё равно что искать среди пассажиров метро женщин по наличию у них ног.

В-четвёртых, смущает почти весь анализ мононуклеаров периферической крови на рисунке 3. Я даже не говорю про то, что можно было бы сделать хоть технические повторности, раз уж пациент только один. Но я так и не нашла по какому маркеру определялось количество МСК и ГСК в крови. Указанные CD90 (встречается и на МСК, и на клетках крови) и CD59 (встречается почти везде) вообще не подходят, опять судим по наличию ног.

Также мне непонятно, откуда взялась мысль проверить экспрессию Sox2, он характерен больше для плюрипотентных стволовых клеток и нейрональных стволовых клеток, а не для регенерирующей ткани. Но, возможно, тут сыграл свою роль хайп с коктейлем Яманаки и авторам очень надо было показать что-то про стволовость. Кстати, по последним данным активная экспрессия Sox2 характерна для опухолей, так что при условии, что данные честные, у пациента кажется ничего хорошего не развивается. Особенно на фоне того, что операция ему понадобилась из-за рака трахеи. Но на момент 2011 года негативная роль Sox2 была показана в основном для глиобластомы, что не умаляет странности метода оценки в принципе. 

Понятно, что этим рисунком авторы явно хотели показать, что вот как классно у пациента увеличивается количество стволовых клеток для обеспечения регенерации, но почему-то смотрели они их в крови, а не в сайте регенерации, да еще и весьма сомнительным образом. Лучше бы оценили саму регенерацию, например, качественным анализом ткани при заборе биопсии.

В пятых, для анализа восстановления лёгочного эпителия авторы измеряли уровень miR-34 и miR-449 в сыворотке крови. Именно в крови, а не, например, в бронхоальвеолярном лаваже, что было бы точнее как минимум анатомически. Но проблема еще и в том, что в целом микроРНК могут регулировать кучу мишеней. На 2011 год данных по конкретно этим молекулам было не очень много, в основном описана их роль в стимуляции аутофагии и торможении роста опухоли. Ну и собственно статья, на которую ссылаются Маккиарини и ко, показывающая, что увеличенная экспрессия miR-449 связана с дифференцировкой легочного эпителия. Её я тоже глянула, не уверена, что данные убедили меня в том, что "miR-449 exquisitely specific biomarker of differentiated airway epithelia", но разбираем мы другую работу. Но что интересно, про miR-34 такого сказано не было, в то время как в работе у Маккиарини он тоже повышался и это было подано как признак регенерации. По современным данным увеличение miR-34 связано со старением, воспалением, высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, - в общем, ни с чем хорошим. 

Вообще, если уж говорить об анализах, то мне было бы гораздо интереснее глянуть на динамику общего анализа и биохимии крови пациента, там как раз и признаки воспаления можно обнаружить, и инфекции. И желательно в течение месяца, 10 дней еще недостаточно для полного перехода на стадию заживления.

И наконец, говоря о более длительном наблюдении, в абстракте указано, что у пациента через 5 месяцев было всё хорошо. Однако в качестве доказательства у нас есть только цифры по функциональному тесту лёгких и гистология. Для меня неубедительно, так как цифры рисуются, а биопсию на гистологию можно брать на правильных местах, тогда и результат будет какой надо. Отдельно, конечно, стоит упомянуть, что патоморфологи очень любят определять тип клеток только на основании окраски гематоксилин-эозин (в статье так определены бокаловидные клетки), но лично я не считаю, что это точный подход. На мой взгляд всё же стоит использовать специфические гистологические или иммуногистохимические методы окрашивания. Но что касается статьи и точки в 5 месяцев, хотелось бы конечно увидеть бронхоскопию или, например, МРТ. Да и вообще, почти весь пул данных касается первых 10 дней, что, конечно, интересно, но никак не говорит об успешности проведения операции.

В общем, возвращаюсь к первоначальной задаче отбора идеи для научного прорыва за государственные деньги. Моё заключение такое: прочитав эту работу, я бы не стала рисковать и запускать проект. Уж слишком много вопросов, много всего не изучено и не показано. Возможно, я бы держала этого автора в голове и следила бы за его успехами. Может, если есть ресурсы, что-то пилотное поставила бы in vitro, а затем на животных и ответила бы на свои вопросы. Но идти с этим к пациентам я бы точно не рискнула.