Buy cocaine Pula

🔥Мы профессиональная команда, которая на рынке работает уже более 5 лет.

У нас лучший товар, который вы когда-либо пробовали!

Buy cocaine Pula

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ (ЖМИ СЮДА)<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

_______________

ВНИМАНИЕ! ВАЖНО!🔥🔥🔥

В Телеграм переходить только по ССЫЛКЕ что ВЫШЕ, в поиске НАС НЕТ там только фейки !!!

_______________

Buy cocaine Pula

Как американская нищета превратилась в «фейковую новость»

Buy cocaine Pula

Mephedrone Albania

Купить мефедрон Акапулько

Buy cocaine Pula

Купить марихуану Солнечный день

Цель этой статьи заключается в предоставления всеобъемлющей, систематической руководства для эффективной очистки гистонов H3 и H4 и количественная оценка остатков ацетилированный гистонов. Во всех эукариотических организмах хроматина, физиологические шаблон всех генетической информации, имеет важное значение для наследственности. Хроматин подлежит массив различных Посттрансляционная изменений PTMs , которые главным образом происходят в амино Термини белков гистонов то есть , гистонов хвост и регулировать доступность и функциональное состояние базового ДНК. Гистона хвосты простираются от ядра нуклеосомой и подлежат Добавление ацетильной группы по гистона acetyltransferases шляпы и удаление ацетильной группы по гистона комплексы ГДА во время клеточного роста и дифференцировки. Конкретные ацетилирования узоры на остатков лизина K на хвосты гистона определить динамический гомеостаза между транскрипционно активной или транскрипционно репрессированных хроматина воздействуя основной сборки гистонов 1 и 2 подбор синергетический или антагонистические хроматина связанных белков на сайте транскрипции. Основные механизм регулирования сложного характера хвост гистона PTMs влияет большинство хроматина шаблонов процессов и приводит к изменениям в созревания клеток и дифференциации в нормальных и патологических развития. Цель настоящего доклада — предоставить эффективный метод для очистки ядра гистоны от клеток и тканей мозга и надежно количественно знаков ацетилирование гистонов H3 и H4 новичков. Эпигенетики термин относится к наследственные изменения активности генов, которые происходят независимо от изменений в ДНК последовательности 1 , 2. Транскрипции гена и репрессий, определяются путем 1 доступность хромосомной ДНК, обернутые вокруг octamer основных белков гистонов две копии каждого из H2A, H2B, H3 и H4 и 2 наличие факторов транскрипции и эшафот белки Набор для конкретной промоутера сайтов 3 , 4. Транскрипции гена регулируется фермента опосредованной изменения конкретной промоутера сайтов ДНК и PTMs гистона хвосты 5 , 6 , 7. N-Термини гистонов H3 и H4 являются среди наиболее сохранившихся последовательностей, известный в эукариотических организмов 3 , и их Посттрансляционная модификации широко задокументированы играть центральную роль в определении структуры хроматина и 8 , функции 9. PTMs на хвосты гистонов то есть , ацетилирования, метилирование, фосфорилирование и ubiquitination изменить потенциал взаимодействия хвосты, влияют на структурное состояние и складывающиеся chromatin волокна и, таким образом, регулировать ДНК доступность и обработка 4 , 10 , , 11 Ацетильной группы являются добавляется и удаляется из остатков K решкой гистона набором конкретных взаимодействующих гистона эпигеномные ферментов, а именно шляпы и гда, соответственно Например для того чтобы активировать транскрипцию генов, связанных с памяти приобретения и консолидации 14 ранее доказано ацетилирование гистона H4 в лизине 12 H4K12ac. Кроме того несколько линий доказательств предполагают, что фермент опосредованной эпигеномные контроль транскрипции гена является важнейшим аспектом здорового клеточного роста и дифференцировки 6 , Чередование в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов, либо путем эпигеномные изменения ДНК мутации эпигеномные ферментов, сами, было показано, быть dysregulated в заболеваний человека, где изменения в деятельности конкретной гена является визитной карточкой патологии например , рак 6 , 16 , Таким образом оценка изменений в ядро гистона PTMs становится мишенью высокой стоимости для потенциальных терапевтических вмешательств. Однако определение изобилие, взаимодействия партнеров и конкретной роли гистонов PTMs была доказана сложной В нынешнем докладе оптимизированная, средне-пропускная способность стратегия для очистки ядра гистонами от клеток и тканей мозга в одну фракцию и полный протокол для количественной оценки гистонов H3 и H4 PTMs описана. Следует отметить хотя в настоящее время опубликованы на кислотной основе методов очистки и стратегии обнаружения на основе антител гистона широко приняты для характеризации гистонов, им не хватает описательные сведения о критических этапов процедуры, таким образом препятствование быстрый и воспроизводимые гистона добычи и количественной оценки. Например обработка ячейки извлечь и биопсия ткани требует различные инструменты и технологии для успешной добычи. Кроме того оптимизированный протокол, представленный в текущем рукописи демонстрирует практический, средне-пропускная способность подход. Основные гистонами извлекаются как единый, чистая доля, которая позволяет надежный течению антитела опосредованной PTM обнаружения без какого-либо вмешательства от примесей. Кроме того в текущем рукописи, был обход проблемы относительно гистона обнаружения из-за их небольшой молекулярной массой. Как правило отсутствие совместимости между очистки, количественной оценки и Протоколы электрофореза геля помешать ученых получение воспроизводимых и убедительных результатов. Здесь представлен Оптимизированный рабочий процесс для очистки ядра гистонами от клеток и тканей и подготовить их к течению PTM анализов через западную помарку. Текущий протокол позволяет очистки белков гистонов ядро при сохранении их родной Посттрансляционная модификации то есть , ацетилирования, метилирование и фосфорилирование. Рисунок 1 изображает Хронология гистона очистки протокола. Все эксперименты были одобрены в Университете Майами Миллер школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитет IACUC и проведены согласно спецификации низ. Чтобы проиллюстрировать прогрессирование гистона очистки протокола и состав всех проанализированных фракций, мы оценивали разные гистона выдержки из клетки микроглии человеческого BV2. Чтобы продемонстрировать количественная оценка гистонов H3 и H4 PTMs то есть , ацетилирования , мы использовали лизатов ткани мозга. BV2 клетки были покрытием на 5 х 10 6 клеток на блюдо в 10 см культуры ткани лечение блюда и позволил расти confluency за 48 ч. Затем были собраны клетки, и гистонов были освобождены от хроматина инкубации в извлечения буфер, содержащий 0,4 М Серная кислота, 1 мм KCl, 1 мм MgCl 2 , 50 мм трис-HCl рН 8. Извлечение времени, от 15 мин до 24 ч, не затрагивают общий состав сырой гистона выдержки определяется Кумасси синим окрашивание рис. Далее, сырой гистонами перешли через столбцы уравновешенной гистона и потока через был проанализирован. Высокая эффективность связывание столбцов определяется отсутствие белка гистонов в проточное когда анализируемой Окрашивание Кумасси синим. Все мембраны с привязанного гистонами затем промывали три раза с мыть буфер для удаления любых оставшихся примесей, оставляя только гистоны обязан силикагель. Мы установлено, что для извлечения всех гистона раз то есть , 15 мин, 2 ч. Таким образом в зависимости от типа образца, последние два моет может быть опущен. Мы наблюдали, что 24 h извлечения время увеличивается количество гистонов H3 и H4 в очищенную фракцию по сравнению с 15 мин и 2 h извлечения времени Рисунок 5A. Второй элюции из столбца не завершились высокого качества или высокой количество гистонов Рисунок 5B. Далее мы использовали ткани гомогенатах мозга для количественного определения гистонов H3 и H4 PTMs, а именно ацетилирования. Таким образом H4K12ac антитела не имеют высокую специфичность рис. Гистона очищения и осадков была выполнена согласно протокола здесь описано. Использование очищенной гистонов H3 и H4 дроби, мы выяснили, что M 2. Студент непарные t -тест был использован для сравнения управления против лечение клетки. Рисунок 1: Хронология протокола очистки гистонов. Ниже приведены все шаги для анализа гистона наряду с предполагаемое время, необходимое для каждого шага. Рисунки с изображением результатов конкретных шагов и представлены в рамках рукопись упоминаются в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя сырой гистонов, извлеченные из клеток BV2. BV2 клетки были культивировали в течение 48 часов до начала протокол извлечения гистонов. Сырой гистонами были извлечены за 15 мин, 2 ч. Nonhistone и гистонов белки присутствуют в нефти гистона экстракт. Рисунок 3: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя столбец потока через следующие гистона очистки шагов от клеток BV2. После сырой гистонов, проходя через столбец привязки гистонов только nonhistone белки присутствуют в поток через. Гистоны отсутствуют в этой фракции. Рисунок 4: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя столбец мыть после шага очистки гистона из клеток BV2. Независимо от извлечения раз гистонов, которые были A 15 мин, B 2 h, или C 24 ч, низкое количество белков nonhistone присутствовали только в столбце первой мойка histonebinding. Гистоны отсутствовали в всех моет. Рисунок 5: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя смывах после шага очистки гистона из клеток BV2. A высокое качество очищенной и обессоленной гистонов H3 и H4 были обнаружены после первого элюции в столбце очистки гистонов. B второй элюции гистона Очищение колонки не дали высокое качество или количество гистонов H3 и H4. Рисунок 6: широко действующей HDAC ингибиторов, tributyrin, увеличивает H4K12 ацетилирования в весь мозг мышей дикого типа. A группа показывает представитель Западной пятно с изображением увеличение H4K12 ацетилирования в сырой гистона извлечь собранные от весь мозг мышей дикого типа в ответ на широко действуя HDAC ингибиторов, tributyrin. B Эта группа показывает количественная оценка увеличения в H4K12 ацетилирования в естественных условиях. P Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. A группа показывает представитель западной помарки, изображающие увеличение H4K12 ацетилирования в очищенной и обессоленной гистона экстракт собранных из префронтальной коры 3 x Tg-AD мышей в ответ на ингибирование гда M Непарные t -тест был использован для сравнения групп t 6 Таблица 1: Оптимизированные условия для гомогенизации ткани мозга. В текущей работе мы продемонстрировали оптимизированный метод для очистки ядра Гистоны и количественно гистонов H3 и H4 PTMs например , ацетилирования. Представленные протокол является всеобъемлющий рабочий процесс, который включает оптимизированные процедуры в отношении клеток и подготовка тканей мозга, сырой гистона очистки и подробные гистона осадков, элюирование и количественной оценки, которые следуют гистона электрофореза и надежные гистона PTM количественной оценки. Большое количество деталей, здесь позволяет для воспроизводимых поколения высокого качества данных, несмотря на необходимость в длительных манипуляций гистона образцов. Многие в настоящее время опубликованы протоколы требуют использования ВЭЖХ изолировать чистой доли гистонов H3 и H4 Хотя ВЭЖХ является мощным средством, ее сложности и низкой пропускной способности сдерживать большинство молекулярные биологи и неспециалистов из его частое использование. Действительно ВЭЖХ не доступен для многих лабораториях, и высоко квалифицированного персонала, необходимого для работы инструмента. ВЭЖХ зачастую длительным, дорогостоящим и потенциально опасных. Представленные здесь является недорогой, средне-пропускная способность стратегии для достижения результатов аналогичного качества, который обходит ВЭЖХ. Сообщил стратегия также более практичным и подходит для использования в почти любой лаборатории, как он использует простой спин столбец подход, который не требует навыков работы специализированный инструмент. PTMs чрезвычайно чувствительны к изменениям в окислительного стресса и изменения рН в 20 , Таким образом в отличие от ранее опубликованные методы 18 , мы приводим эффективную стратегию полоскания клеток в сыворотке свободных СМИ обеспечить минимальный метаболические нарушения клеток и избегать вмешательства родной PTMs с компонентами сыворотки. Текущий протокол не только обходит изоляции традиционными ядер, но и обеспечивает оптимальное время для лизиса клеток и точное ткани гомогенизации процедура, которая позволяет для сохранения ядерная оболочка избегая ядерной агрегации. Хотя время извлечения можно манипулировать основанные на количество клеток, используется тип ячейки, размер ткани и т. Важно отметить, что несколько контрольно-пропускных пунктов в рамках протокола существует для проверки успешного гистона очистки например , шаги 2. Эта стратегия также облегчает диагностику на протяжении длительной процедурой. Еще одной важной и уникальной особенностью представленных протокола является его полную совместимость с течению западной помарке инструменты анализа и другие по желанию. Использование системы передачи высокой производительности и высокой пропускной способности в сочетании с гелями белка оптимальное разрешение позволяет для поддержания деятельности в отсутствие SDS и высокой эффективности и родной подтверждение белка в отсутствие SDS низкомолекулярных белков гистонов таким образом обеспечивая количественную оценку PTM надежный гистонов. Janczura, K. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Neuroscience. После того, как клетки достигли желаемого confluency, нежно аспирационная культуры средств массовой информации и вымыть клетки 2 x с подогретую сыворотки свободных СМИ под капотом культуры ткани. Используйте пластиковые клетки скребок для собирать все клетки в буфере извлечения соскоб и передавать их на 1,5 мл, помечены трубка с мкл пипетки. Накапайте клетки вверх и вниз 3 x для облегчения гомогенизации. Закройте все трубы и немедленно положить их на льду. Ткани мозга Если используется замороженные ткани, ткани в prechilled 1,5 мл трубку и кратко оттепели на льду. Если используются свежие ткани, немедленно приступить к шаг 1. Примечание: Текущий протокол описывает процедуры с использованием замороженных мыши мозга и мыши префронтальной коры образцов. Однородный тканей, с использованием карманных Dounce гомогенизатор, используя соответствующее количество извлечения буфера и рекомендуемое количество штрихов Таблица 1. Чтобы избежать чрезмерного хроматина измельчения, не превышают количество рекомендуемых штрихов. С помощью пипетки одноканальный мкл, передать prechilled 1,5 мл огневки. Примечание: Время добыча может различаться для разных клеток и тканей типа и должны быть оптимизированы для каждой процедуры. Текущий протокол представляет результаты, полученные после 15 мин, 2 h и 24 h добычи Рисунок 2 , рис. Передача супернатанта, включая сырой гистонов к новой, prechilled 1,5 мл. Выбросите гранулы. Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз 6 x. Проверьте рН в смеси с рН полоски. Корректировать, добавив больше нейтрализации буфера для достижения рН 7. Оценивать наличие гистона и nonhistone белков в сырой гистона извлечь следующим образом рис. Примечание: Сырой гистонов рис. Очистка Core гистонами Спиновые столбца уравновешивания Добавьте мкл буфера уравновешивания каждый спин столбец используется. Не прикасайтесь столбца мембраны. Отказаться от потока через. Повторите 1 x. Очистка гистона Добавьте мкл пример интерес из шага 2. Соберите потока через. Повторите предыдущий шаг столько раз, сколько необходимо загрузить весь образец на столбец. Не переполняйте столбце спина. Объединить потока через от каждого шага центрифугирования для анализа эффективности связывание столбцов рис. Выполните шаг 2. Колонка мыть мкл буфера мытья, для каждого столбца. Соберите потока через стирка стирать 1. Повторите шаг 3. Соберите моет потока через 2 и 3. Не пула последовательных столбцов потока через смывки. Для дальнейшей оценки эффективности гистон привязка столбца, проанализируйте три колонки моет, выполнив шаг 2. Элюирующий гистона Перевести столбец в новой маркировкой 1,5 мл трубки. Добавьте 50 мкл гистона Элюирующий буфер. Сохранение потока через содержащих гистоны. Для дополнительного элюции повторите шаг 3. Не следует сочетать первого и второго потока через элюаты, как они отличаются в количестве гистона и чистоты. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости от стенки трубки. Смешайте закупорить вверх и вниз 6 x. После центрифугирования, небольшой белые гранулы, содержащие осажденный гистонами будет видна в нижней части трубки. Сделать не вихревой образца. Тщательно удалить супернатант. Повторите шаг 4. Не нарушая гранулы, мкл ледяной ацетона. Тщательно удалить супернатант, оставить трубы контаминированных и позволить образца сушиться на льду на 30 мин проверить, если все остаточные ацетон испарилась. Оставьте трубы контаминированных и позволяют образца высохнуть при комнатной температуре RT 5 мин. Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл стерильной воды. Сделать не накапайте вверх и вниз. Флик трубку осторожно с пальцем. Cap все трубы и позволяют гистонами воссоздать на льду на минут, в зависимости от размера гранул. Проверьте, если высокомобильна гранулы. Cap все трубы и позволяют гранулы для дальнейшего Ресуспензируйте на RT на 5 мин. Примечание: Это решение первый и второй элюции от шага 3. Количественная оценка Eluted гистоны Используйте спектрофотометр согласно производителя протокол для количественного определения общего гистоны, полученные после окончательного элюции в шаге 4. Измерение оптической плотности на Нм. Используйте следующую формулу для расчета концентрации гистонов x : Здесь ОД является оптическая плотность измеряется в A Нм. Западный анализ помаркой Отрегулируйте очищенный и eluted гистона от шаг 4. Добавьте соответствующий объем воды и 4 x Laemmli буфер образца для настройки загрузки томов. Охладьте их на льду. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости и конденсации от стенки трубки. Примечание: Первый элюции гистоны содержит высококачественные гистонов Рисунок 5A , а второй элюции низкой не уровням гистонов Рисунок 5B. Чтобы подсчитать гистона PTMs, используйте систему передачи см. Roll мембраны нежно с роликом пятно удалить воздух из стека и мембраны. Положите гель на вершине мембраны, ролл аккуратно с роликом пятно удалить воздух из мембраны и лари и место Топ стека на геле. Рулон осторожно снова поместите крышку кассеты поверх сэндвич, нажмите вниз твердо и поверните по часовой стрелке для блокировки Ноб. Вставьте кассету в слот системы передачи. На экране аппарата выберите Протокол Turbo. Используйте протокол 3 мин для одной мини-гель или 7 мин протокол для более чем двух мини-гели. Пятно мембраны с Пуансо пятно на 5 мин и визуализировать всего гистоны. Мыть их в 1 x трис амортизированное saline TBS с 0. Примечание: В текущей протокол, антител против ацетилированный гистонов H4K12 Рисунок 6 и рис. Средний возраст: 16 месяцев. Средний вес: 30 грамм. Play Video. Cite this Article Janczura, K. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close.

Марихуана Плайя-дель-Кармен

Buy cocaine Pula

Купить мефедрон Доминикана