Биосинтез 2Н-меченого бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium - Биология и естествознание статья

Главная

Биология и естествознание
Биосинтез 2Н-меченого бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium

Осуществлен биосинтез мембранного белка бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium, меченного дейтерием по остаткам фенилаланина, тирозина и триптофана. Выделение фракции пурпурных мембран.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
БИОСИНТЕЗ 2 Н-МЕЧЕНОГО БАКТЕРИОРОДОПСИНА ГАЛОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИЕЙ HALOBACTERIUM HALOBIUM
* Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86;
Осуществлен биосинтез мембранного белка бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium , меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, [3, 5- 2 H 2 ]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофана. Комбинацией методов разделения и анализа, включая электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-200, обращенно-фазовую ВЭЖХ, спектроскопию 1 Н ЯМР и масс-спектрометрию электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных-производных аминокислот, доказаны гомогенность синтезируемого 2 Н-меченого БР и селективность включения дейтерия в молекулу.
Ключевые слова: Halobacterium halobium; [2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланин, [3, 5- 2 H 2 ]тирозин, [2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофан, 2 Н-меченый бактериородопсин; биосинтез; масс-спектрометрия
Основными этапами исследования являлись: выращивание штамма экстремальных галофильных бактерий H. halobium на синтетической среде с [2, 3, 4, 5, 6- 2 Н 5 ]фенилаланином (0.26 г/л), [3, 5- 2 H 2 ]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофаном (0.5 г/л), выделение фракции пурпурных мембран (ПМ), отделение от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, фракционирование солюбилизированного в 0.5% ДДС-Na белка метанолом, гель-проникающая хроматография на сефадексе G-200, электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na (рис.2). Поскольку белок локализуется в ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после удаления 4.3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточной РНК. Поскольку фракция ПМ наряду с искомым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло задачу выделения индивидуального БР с применением методов декаротинизации и делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация, заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при -5 0 С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ (степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 3 на различных стадиях обработки ( б ) и ( в ) относительно нативного БР ( а ). Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле БР приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 3, в ) основная полоса (1) при максимуме поглощения 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием транс -ретинального остатка ретиналя БР 568 , дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M 412 c депротонированной альдиминной связью между остатком транс -ретиналя и белком, а полоса (3) при 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого БR соотношение D 280 /D 568 равно 1.5:1).
Фракционирование и тщательная хроматографическая очистка белка являлись следующим необходимым этапом. Поскольку БР, будучи трансмембранным белком ( М r 26.7 кД), пронизывает билипидный слой в виде семи -спиралей, применение сульфата аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму солюбилизацией в 0.5% ДДС-Na. Использование ионного детергента ДДС-Na диктовалось необходимостью максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и осаждения в нативном виде, поскольку солюбилизированный в слабоконцентрированном растворе ДДС-Na (0.5%) БР, сохраняет спиральную -конфигурацию [9]. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей ацетона, метанола и хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование. Значительным преимуществом метода является, что целевой белок в комплексе с молекулами липидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а другие высокомолекулярные примеси в непрореагировавшем осадке, легко отделяемом центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0.5% ДДС-Na белка с его последующим выделением в кристаллическом виде достигали в три стадии дробным низкотемпературным (-5 0 С) осаждением метанолом, уменьшая концентрацию детергента соответственно в 2.5 и 5 раза. Окончательная стадия очистки БР заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом гель-проникающей хроматографии, для чего БР-содержащие фракции дважды пропускали через колонку с декстрановым сефадексом G-200, уравновешенную 0.09 М Трис-боратным буфером (рН 8.35) с 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА (рис.3). Согласно разработанному методу фракционирования получено 8-10 мг 2 Н-меченого БР из 1 г бактериальной биомассы, гомогенность которого удовлетворяла требованиям, предъявляемым для реконструкции мембран и подтверждалась электрофорезом в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, регенерацией апомембран с транс -ретиналем и обращенно-фазовой ВЭЖХ метиловых эфиров N-Днс-аминокислот. Небольшой выход БР не был препятствием для последующего масс-спектрометрического анализа, однако здесь необходимо подчеркнуть, что для обеспечения высокого выхода белка необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы.
Условия проведения гидролиза 2 Н-меченого БР определялись необходимостью предотвращения реакций изотопного ( 1 Н- 2 Н) обмена водорода на дейтерий в молекуле фенилаланина и сохранения остатков триптофана в белке. Рассматривались два альтернативных варианта кислотный и щелочной гидролиз. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 н. HСl или 8 н. H 2 SO 4 , 110 0 С, 24 ч), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке [10], которые для настоящего исследования не играют существенной роли. Модификация этого метода, заключающаяся в добавлении в реакционную среду фенола [11], тиогликолевой кислоты [12], -меркаптоэтанола [13], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Использование п-толуолсульфокислоты с 0.2% 3-(2-аминоэтил)-индолом или 3 М меркаптоэтансульфокислоты [14] также эффективно для сохранения триптофана (до 93%) [15]. Однако для решения поставленной задачи вышеперечисленные методы непригодны, поскольку обладают существенным недостатком: в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью происходит изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [16], а также протонов при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [17]. Поэтому даже проведение гидролиза в дейтерированных реагентах (6 н. 2 HCl, 4 н. 2 H 2 SO 4 в 2 H 2 O) не позволяет получать реальные данные о включении дейтерия в белок.
В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH) 2 или 4 н. NaOH, 110 0 C, 24 ч) реакций изотопного обмена водорода практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2 гистидина, а триптофан не разрушается, что определило выбор метода гидролиза в настоящей работе. Упрощение процедуры выделения смеси свободных аминокислот за счет нейтрализации серной кислотой явилось причиной выбора в качестве гидролизующего агента 4 н. Ba(OH) 2 . Возможная D , L -рацемизация аминокислот при щелочном гидролизе не влияла на результат последующего масс-спектрометрического исследования уровня дейтерированности молекул аминокислот.
Таблица. Величины пиков (М) + в масс-спектре электронного удара метиловых эфиров N- Dns-[2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, N-Dns-[3, 5- 2 H 2 ]тирозина и N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофана.
Уровень дейтерированности, % от общего количества атомов водорода
N- Dns-[2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]Phe-Ome
N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]Trp-OMe
Для изучения уровня дейтерированности 2 H-меченого БР использовали метод масс-спектрометрии электронного удара (чувствительность 10 -8 -10 -10 моль анализируемого вещества [18]) после модификации смеси свободных аминокислот гидролизата БР в метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот. Чтобы получить воспроизводимый результат по уровню дейтерированности 2 Н-меченого белка, сначала регистрировали полный скан масс-спектр электронного удара смеси метиловых эфиров N-Днс-производных 2 Н-меченых аминокислот, по пикам молекулярных ионов которых (М) + рассчитывали уровень дейтерированности молекулы. Затем проводили разделение метиловых эфиров N-Днс-производных ароматических аминокислот обращенно-фазовой ВЭЖХ и получали масс-спектры электронного удара для каждой индивидуальной аминокислоты. Полный масс-спектр электронного удара смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот, показанный на рис. 4 (сканирование при m/z 50-640, базовый пик m/z 527, 100%), отличался непрерывностью, пики в интервале m/z от 50 до 400 на шкале массовых чисел представлены фрагментами метастабильных ионов, низкомолекулярных примесей, а также продуктами химической модификации аминокислот. Анализируемые 2 Н-меченые ароматические аминокислоты, занимающие шкалу массовых чисел m/z от 415 до 456 представлены смесями молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия, поэтому молекулярные ионы (М) + полиморфно расщеплялись на отдельные кластеры со статистическим набором значений m/z зависимости от количества водородных атомов в молекуле. Учитывая эффект изотопного полиморфизма, подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по наиболее распространенному пику молекулярного иона (М) + в каждом кластере с математически усредненной величиной (М) + (рис. 4) для фенилаланина пик молекулярного иона определялся (М) + при m/z 417, 14% (вместо (М) + при m/z 412, 20% для немеченого производного (пики немеченых аминокислот не показаны)), тирозина (М) + при m/z 429, 15% (вместо (М) + при m/z 428, 13%), триптофана (М) + при m/z 456, 11% (вместо (М) + при m/z 451, 17%). Уровень дейтерированности, соответствующий увеличению молекулярной массы составил для тирозина два, фенилаланина и триптофана пять атомов дейтерия. Полученные данные по уровню дейтерированности фенилаланина, тирозина и триптофана позволяют сделать вывод о высокой селективности включения 2 H-меченых ароматических аминокислот в молекулу БР: дейтерий детектировался во всех остатках ароматических аминокислот (таблица). Обсуждая полученные результаты, необходимо подчеркнуть, что присутствие в масс-спектре пиков (M) + протонированных и полудейтерированных аналогов фенилаланина с (M) + при m/z 413-418, тирозина с (M) + при m/z 428-430 и триптофана с (M) + 453-457 с различными вкладами в уровни дейтерированности молекул, свидетельстствует о сохранении небольшой доли минорных путей биосинтеза de novo , приводящим к разбавлению дейтериевой метки и, по-видимому, определяется самими условиями биосинтеза 2 Н-меченного БР (таблица).
Согласно данным масс-спектрометрического анализа, пики молекулярных ионов (М) + метиловых эфиров N-Днс-производных ароматических аминокислот обладали очень низкой интенсивностью и полиморфно расщеплялись, поэтому области их молекулярного обогащения были сильно уширены. Кроме этого, масс-спектры компонентов смеси аддитивны, поэтому смеси можно анализировать, только если имеются спектры различных компонентов, записанные в тех же условиях [8]. Проводимые вычисления предусматривают решение системы из n уравнений с n неизвестными для смеси из n компонентов. Для компонентов, концентрация которых превышает 10 мол.%, правильность и воспроизводимость результатов анализа составляет +0.5 мол.% (при доверительной вероятности 90%). Поэтому для получения воспроизводимого результата необходимо хроматографически выделять индивидуальные производные 2 Н-меченых аминокислот из белкового гидролизата. Для решения поставленной задачи использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ на октадецилсилановом селикагеле силасорб С18, эффективность которого подтверждалась разделением смеси метиловых эфиров N-Днс-производных 2 Н-меченых аминокислот из других микробных объектов, как метилотрофные бактерии и микроводоросли [19]. Метод удалось адаптировать к условиям хроматографического разделения смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот гидролизата БР, заключающийся в оптимизации соотношения элюентов, форме градиента и скорости элюции с колонки. Наилучшее разделение достигалось при градиентной элюции метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот смесью растворителей ацетонитрил : трифторуксусная кислота = 100 : 0.1 - 0.5, об.%. При этом удалось разделить триптофан и трудно разрешимую пару фенилаланин/тирозин. Степени хроматографической чистоты выделенных метиловых эфиров N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, N-Днс-[3, 5- 2 H 2 ]тирозина и N-Днс-[2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофана составили 89, 91 и 90% при выходах 78-85%. Полученный результат подтвердил рис. 4, б на котором приведен масс-спектр электронного удара метилового эфира N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, выделенного обращенно-фазовой ВЭЖХ (сканирование при m/z 70-600, базовый пик m/z 170, 100%) (масс-спектр приведен относительно немеченого метилового эфира N-Днс-фенилаланина ( а ), сканирование при m/z 150-700, базовый пик m/z 250, 100%). Доказательством включения дейтерия в молекулу фенилаланина является пик тяжелого молекулярного иона метилового эфира N-Днс-фенилаланина ((М) + при m/z 417, 59% вместо (М) + при m/z 412, 44% для немеченого производного фенилаланина) и дополнительный пик бензильного фрагмента фенилаланина С 7 Н 7 + при m/z 96, 61% (вместо m/z 91, 55% в контроле (не показан)) (рис. 5, б ). Пики второстепенных фрагментов различной интенсивности со значениями m/z 249, 234 и 170 принадлежат к продуктам вторичного распада дансильного остатка до N-диметиламинонафталина, низкоинтенсивный пик (M COOCH 3 ) + при m/z 358, 7% ( m/z 353, 10%, контроль) является продуктом отщепления карбоксиметильной СООСН 3 -группы из метилового эфира N-Днс-фенилаланина, а пик (M + CH 3 ) + при m/z 430, 15% ( m/z 426, 8%, контроль) продуктом дополнительного метилирования по -аминогруппе фенилаланина (рис. 5, б ). Согласно данным масс-спектра, разница между молекулярной массой легкого и тяжелого пиков [M] + метилового эфира N-Днс-фенилаланина составляет пять единиц, что совпадает с полученными ранее данными по уровню дейтерированности исходного [2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, добавляемого в среду выращивания (масс-спектрометрические данные по уровням дейтерированности [2, 3, 4, 5, 6- 2 H 5 ]фенилаланина, [3, 5- 2 H 2 ]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7- 2 H 5 ]триптофана подтверждены спектроскопией 1 Н ЯМР и находятся в корреляции).
Полученные экспериментальные данные, свидетельствуют о высокой эффективности включения дейтерия в молекулу БР. Планируется использовать полученные дейтерированные препараты БР для реконструкции в 2 Н 2 О функционально активных систем мембранных белков с очищенными 2 Н-мечеными жирными кислотами и другими биологически активными соединениями.
Бактериальные штаммы и питательные среды. Выделение фракции пурпурных мембран. Выделение бактериородопсина. Гидролиз бактериородопсина. Получение дансиламинокислот гидролизатов бактериородопсина. Получение метиловых эфиров дансиламинокислот. статья [953,3 K], добавлен 23.10.2006
This method is based on the growth of the strain of halophilic bacteria Halobacterium halobium on a synthetic medium containing 2H-labeled aromatic ammo acids and fractionation of solubilized protein by methanol, including purification of carotenoids. статья [2,0 M], добавлен 23.10.2006
Осуществлен биосинтез 2Н-меченого пуринового рибонуклеозида инозина с использованием адаптированного к дейтерию штамма Bacillus subtilis в тяжеловодородной среде высокого уровня дейтерированности с гидролизатом биомассы метилотрофной бактерии. статья [2,5 M], добавлен 23.10.2006
Бактериальные штаммы. Культивирование B. subtilis. Выделение инозина. Получение дейтерий-меченного инозина. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик B. subtilis. Исследование степени дейтерированности инозина. статья [798,8 K], добавлен 23.10.2006
Характеристика биосинтеза как процесса образования органических веществ, происходящего в клетках с помощью ферментов и внутриклеточных структур. Участники биосинтеза белка. Синтез РНК с использованием ДНК в качестве матрицы. Роль и значение рибосом. презентация [2,3 M], добавлен 21.12.2013
Биосинтез как направление телесно-ориентированной (соматической) психотерапии. Происхождение жизни в ее современной клеточной форме, возникновение механизма наследуемого биосинтеза белков. Рибонуклеиновые кислоты, эволюция и специализация молекул РНК. реферат [588,5 K], добавлен 07.06.2010
Предмет изучения молекулярной биологии. Требования к решению задач на установление последовательности нуклеотидов в ДНК, иРНК, антикодонов тРНК, специфика вычисления количества водородных связей, длины ДНК и РНК. Биосинтез белка. Энергетический обмен. презентация [111,0 K], добавлен 05.05.2014
Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д. PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах. Рекомендуем скачать работу .

© 2000 — 2021



Биосинтез 2Н-меченого бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium статья. Биология и естествознание.
Реферат На Тему Правовий Статус Слідчого Овс
Реферат Использование Игровых Технологий В Обучении Плаванию
Контрольная Работа По Безопасности Жизнедеятельности
Художественное И Деловое Описание Человека Контрольная Работа
Курсовая работа по теме Альтернативные источники энергии. Грозовая электростанция
Реферат по теме Процессоры. История развития. Структура. Архитектура
Реферат по теме Третий закон Паркинсона
Реферат: Государственные финансы понятие, структура, функции
Оренбургская Область В Сочинениях Историков
Neologisms Курсовая Работа
Топик На Тему Героические Страницы Русской Истории
Реферат по теме Кто или что должно рекламировать продукт или услугу, чтобы рекламу увидели и поняли?
Сколько Дней До Итогового Сочинения
Реферат: Нестеров М.В.. Скачать бесплатно и без регистрации
Реферат: Chinese Buddhism Essay Research Paper Chinese Buddhism
Реферат На Тему Выдающиеся Психологи России
Дипломная работа по теме Система профилактических мер криминологического характера в Челябинской области
Реферат: Старуха Изергиль Максима Горького. Скачать бесплатно и без регистрации
Реферат: Основные направления экологической политики Республики Казахстан
Сочинение На Тему Минем Яраткан Китабым
Технологии спасения пострадавших в ДТП - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат
Ядовитые технические жидкости - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда курсовая работа
Анатомия и физиология почек человека - Биология и естествознание курсовая работа