Бесплатные пробы Метамфетамин Артём

🔥Мы профессиональная команда, которая на рынке работает уже более 5 лет и специализируемся исключительно на лучших продуктах.

У нас лучший товар, который вы когда-либо пробовали!

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ (ЖМИ СЮДА)<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

_______________

ВНИМАНИЕ! ВАЖНО!🔥🔥🔥

В Телеграм переходить только по ССЫЛКЕ что ВЫШЕ, в поиске НАС НЕТ там только фейки !!!

_______________

Бесплатные пробы Мет, метамфа Артём

Бесплатные пробы Метамфетамин Артём

Норильск купить Метадон VHQ

В этой статье представлен метод генерации кристаллов белка, полученных с помощью I3C 5-амино-2,4,6-трийодоизофталеновой кислоты с использованием микросея, чтобы генерировать новые условия кристаллизации в редких матричных экранах. Лотки могут быть настроены с помощью жидких роботов дозирования или вручную. Разъяснение структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии требует как высококачественных дифракционных кристаллов, так и вычислительного решения проблемы фазы дифракции. Новые структуры, которые не имеют подходящей гомологической модели, часто получают тяжелые атомы для предоставления экспериментальной фазовой информации. Представленный протокол эффективно генерирует производные кристаллы белка путем объединения случайного микросеяного матричного скрининга с производным с тяжелой молекулой атома I3C 5-амино-2,4,6-трийодоизофталиковая кислота. Путем включения I3C в кристаллическую решетку, проблема фазы дифракции может быть эффективно решена с помощью одноволновой аномальной дисперсии SAD поэтапного. Равностороннее расположение атомов йода в I3C позволяет быстро исправлять правильную аномальную подструктуру. Этот протокол будет полезен структурным биологам, которые решают макромолекулярные структуры с использованием методов на основе кристаллографии, интересующихся экспериментальным фазированием. В области структурной биологии рентгеновская кристаллография рассматривается как техника золотого стандарта для определения структуры макромолекулы с атомным разрешением. Он был широко использован для понимания молекулярной основы заболеваний, руководство рациональных проектов дизайна наркотиков и выяснить каталитический механизм ферментов 1 , 2. Хотя структурные данные предоставляют богатые знания, процесс экспрессии и очищения белка, кристаллизации и определения структуры может быть чрезвычайно трудоемким. Обычно встречаются несколько узких мест, которые препятствуют продвижению этих проектов, и это необходимо решить для эффективной оптимизации трубопровода определения кристаллической структуры. После рекомбинантного выражения и очищения необходимо определить предварительные условия, способствующие кристаллизации, что зачастую является трудным и трудоемким аспектом рентгеновской кристаллографии. Коммерческие редкие матричные экраны, которые консолидируют известные и опубликованные условия, были разработаны, чтобы облегчить это узкое место 3, 4. Тем не менее, он является общим для создания нескольких хитов из этих первоначальных экранов, несмотря на использование высоко чистых и концентрированных образцов белка. Наблюдение за явными каплями указывает на то, что белок может не достигать уровня супернасыщения, необходимого для нуклеата кристалла. Для поощрения кристаллизации и роста, семена, произведенные из уже существующих кристаллов могут быть добавлены к условиям, и это позволяет увеличить выборку пространства кристаллизации. Ireton и Stoddard впервые представили метод скрининга матрицы микросея 5. Кристаллы низкого качества были измельчены, чтобы сделать запас семян, а затем систематически добавляются к условиям кристаллизации, содержащим различные соли для создания новых кристаллов дифракции качества, которые иначе не сформировались бы. Это улучшило качество кристаллов и увеличило количество кристаллизации хитов в среднем в 7 раз. После успешного производства кристаллов и получения рентгеновского дифракционного шаблона возникает еще одно узкое место в виде решения «фазовой проблемы». В процессе сбора данных регистрируется интенсивность дифракции пропорционально квадрату амплитуды , но фазовая информация теряется, что порождает фазовую проблему, которая останавливает немедленное определение структуры 8. Если целевой белок разделяет высокую последовательность идентичности белка с ранее определенной структурой, молекулярная замена может быть использована для оценки фазовой информации 9, 10, 11, Хотя этот метод является быстрым и недорогим, структуры моделей могут быть недоступны или пригодны. Эти методы используют компьютерно предсказанные модели или фрагменты в качестве отправной точки для молекулярной замены. Если методы молекулярной замены не удается, прямые методы, такие как изоморфная замена 17 , 18 и аномальное рассеяние на одной длине волны SAD 19 или несколько длин волн MAD 20 должны быть использованы. Это часто имеет место для по-настоящему новых структур, где кристалл должен быть сформирован или выведен с тяжелым атомом. Это может быть достигнуто путем замачивания или совместного кристаллизации с тяжелым соединением атома, химической модификации например, 5-бромурацилов включения в РНК или помечены выражение белка например, включение селенометионина или селеноцистеина аминокислоты в первичную структуру 21 , Это еще больше усложняет процесс кристаллизации и требует дополнительного скрининга и оптимизации. Новый класс фазирования соединений, в том числе I3C 5-амино-2,4,6-трийодоизофталеновая кислота и B3C 5-амино-2,4,6-трибромуазофталовая кислота , предлагают захватывающие преимущества по сравнению с уже существующими соединениями фазирования 23 , 24 , Оба I3C и B3C имеют ароматические эшафот кольца с чередующимся расположением аномальных рассеяний, необходимых для прямых методов поэтапного и аминокислот или карбоксилат функциональных групп, которые взаимодействуют конкретно с белком и обеспечивают связывающую специфичность сайта. Последующее равностороннее треугольное расположение групп тяжелых металлов позволяет упростить проверку фазированной подструктуры. Этот протокол повышает эффективность конвейера определения структуры путем объединения методов производных тяжелых металлов и скрининга rMMS для одновременного увеличения числа кристаллизации хитов и упрощения процесса производных кристаллизации. Мы продемонстрировали, что этот метод был чрезвычайно эффективен с куриным яичным белком лизозимом и областью нового белка лизина из бактериофажа P68 Описано структурированное решение с использованием высокоагматизированных конвейеров определения структуры Auto-rickshaw, специально разработанных для поэтапного соединения I3C. Этот метод особенно полезен исследователям, изучающим белки, не имеющие гомологичные модели в PDB, значительно уменьшая количество этапов скрининга и оптимизации. Предпосылкой для этого метода являются кристаллы белка или кристаллический осадок целевого белка, полученный в ходе предыдущих испытаний кристаллизации. Для обоих белков, единственное добавление I3C не увеличить количество условий, способствующих кристаллизации. Когда I3C был добавлен на экраны HEWL, количество попаданий было сокращено с 31 до 26, подчеркивая дополнительные сложности кристаллизации при введении фазирования соединений рисунок 1A. В соответствии с другими исследованиями, добавление семян в коммерческие редкие матричные экраны для создания экрана rMMS значительно увеличило количество возможных условий кристаллизации для обоих белков, в результате чего в 2,1 и 6 раз больше для HEWL и Orf11 NTD, соответственно 6 , 61 Рисунок 1. Самое главное, одновременное добавление I3C и семян увеличило количество попаданий относительно несеяного экрана, продемонстрировав увеличение в 2,3 и 7 раз для HEWL и Orf11 NTD, соответственно. Посев позволяет тщательно контролировать количество кристаллов на экранах I3C rMMS В экспериментах по микросеянию количество семян, введенных в испытание кристаллизации, можно контролировать путем разбавления семенного запаса, что позволяет точно контролировать нуклеацию при падении 7, Это часто позволяет более крупным кристаллам формироваться, так как существует снижение конкуренции белковых молекул в местах нуклеации. Восстановление состояния кристаллизации, идентифицированного на экране I3C-rMMS с разбавленным запасом семян, дало меньше, но больших кристаллов рисунок 3. SAD поэтапное может быть использовано для решения структур из кристаллов, полученных из экрана rMMS I3C Кристаллы, выращенные с использованием разбавленного семенного запаса, показанного на рисунке 3, использовались для решения структуры белков с использованием SAD phasing с использованием данных дифракции из одного кристалла рисунок 4. Данные были собраны на австралийском синхротроне MX1 луч Подробные детали сбора данных и структурного решения описаны в другом месте Рисунок 1 - rMMS был использован для создания новых условий для роста кристалла в присутствии I3C для двух тестовых белков. A Куриный яичный белок лизозим был протестирован с экраном индекс HT. Треи были посеяны с кристаллами HEWL, выращенными в 0. Лотки Orf11 NTD были посеяны из кристаллов из состояния G12 с несеяного экрана, показанного синим цветом. Условия, поддерживающие рост кристалла, показаны красным цветом. Рисунок адаптирован из Труонг и др. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 - Репрезентативные изображения кристаллов, выращенных в результате диффузионных испытаний пара, показанных на рисунке 1 a и b. Рисунок 3 - Разбавление семенного запаса является эффективным способом уменьшения нуклеации в состоянии кристаллизации, найденной с использованием метода I3C-rMMS, для контроля количества кристаллов, которые образуются. Уменьшение нуклеации в капле часто приводит к росту кристаллов до больших размеров. C Аномальные атомы йода в I3C расположены в равностороннем треугольнике 6. Таким образом, наличие этого треугольника в фазированной подструктуре указывает на то, что в этом положении находится молекула I3C. Определение структуры нового белка при отсутствии подходящей гомологической модели для молекулярной замены требует экспериментального поэтапного отказа. Эти методы требуют включения тяжелых атомов в кристалл белка, что добавляет уровень сложности трубопровода определения структуры и может ввести многочисленные препятствия, которые должны быть решены. Тяжелые атомы могут быть включены непосредственно в белок через маркированные выражения с использованием селенометионина и селеноцистеина. Поскольку этот метод является дорогостоящим, трудоемким и может привести к снижению урожайности белка, маркированный белок часто выражается после того, как условия кристаллизации были найдены и оптимизированы с немаркированный белок. Кроме того, кристаллы могут быть выведены путем замачивания в растворе, содержащем тяжелые атомы 22, 63, Этот метод часто использует высококачественные кристаллы и поэтому выполняется после того, как уже разработан надежный метод кристаллизации. Успешное получение производных кристаллов с использованием этого метода требует дальнейшей оптимизации процедур замачивания и скрининга различных фазовых соединений, поэтому добавляет больше времени к и без того трудоемкому процессу. Сокристаллизация белка с тяжелым атомом может быть выполнена на стадии скрининга, таким образом эффективно оптимизируя процесс и уменьшая шаги манипуляции кристаллом, которые могут привести к повреждению. Тем не менее, по-прежнему существует потенциальный сценарий получения нескольких первоначальных хитов кристаллизации и проблема выбора совместимого тяжелого атома соединения. Многие имеющиеся в настоящее время соединения поэтапного отказа несовместимы с обрывистыми, буферами и добавками, обычно встречаемыми в условиях кристаллизации. Поскольку соединение I3C поэтапно не страдает от этих несовместимостей, это надежное поэтапное соединение, которое может быть поденципным для многих различных условий. В этом исследовании представлен обтекаемый метод производства производных кристаллов, готовых к поэтапному отказу от САД путем одновременной совместной кристаллизации соединения I3C и rMMS. Сочетание обоих методов увеличивает количество кристаллизации хитов, со многими условиями, имеющих улучшение морфологии и дифракции характеристики. Потенциально I3C может благоприятно связываться с белком, способствуя образованию и стабилизации кристаллических контактов В свою очередь, это может вызвать кристаллизацию и, возможно, улучшить дифракционные характеристики. Помимо того, что соединение совместимо с редкими матричными экранами, I3C также является привлекательным соединением поэтапного отказа из-за его внутренних свойств. Функциональные группы, которые чередуются с йодом на ароматических эшафот кольцо позволяют конкретные связывания с белками. Это приводит к большей заполняемости и потенциально уменьшает фоновый сигнал Кроме того, расположение аномальных рассеяний в равностороннем треугольнике очевидно в подструктуре и может быть использовано для быстрой проверки связывания I3C рисунок 4B и 4C. Наконец, он может производить аномальный сигнал с настраиваемым синхротронным излучением, а также хромом и медью вращающихся рентгеновских источников анода. Таким образом, он может быть применен к различным рабочим процессам. Поскольку I3C широко доступен и недорог в покупке, этот подход находится в пределах досягаемости для большинства лабораторий структурной биологии. Существует несколько экспериментальных соображений, которые необходимо учитывать при использовании метода I3C-rMMS. Этот метод не может быть применен, если первоначальный кристаллический материал белка не может быть получен. В сложных случаях кристаллический материал из гомологового белка также может быть использован для генерации семенного запаса. Этот кросс-посев подход к rMMS показал некоторые многообещающие результаты 7. Оптимизация кристаллического числа за счет разбавления семенного запаса является важным шагом, который не следует упускать из виду, чтобы максимизировать шансы на производство высококачественных крупных кристаллов и получение подходящих данных дифракции. Если в асимметричной единице выявлено несколько участков I3C, условия, способствующие кристаллизации, следует дополнительно оптимизировать с повышенной концентрацией I3C. Это может увеличить заполняемость I3C, чтобы максимизировать аномальный сигнал и помощь кристалла вытекают. Там могут быть случаи, когда этот метод не может быть оптимальным методом для производных кристаллов белка. По мере увеличения размера белка или белкового комплекса ограниченное число сайтов I3C на поверхности белка может не обеспечить достаточную силу поэтапного решения структуры. В этих сценариях, где размер белка, как сообщается, является мтукации, селенометионин маркировки белка может быть более жизнеспособным подходом к поэтапному отказу от белка. Если белок имеет достаточное количество остатков метамфетамина в белке рекомендуется иметь по крайней мере один methionine на остатков 65 и высокая эффективность селенометионина включения в белок может быть достигнуто например, в бактериальных систем выражения 66 , несколько высокой занятости атомов селена будет присутствовать в кристаллах фазы структуры. Кроме того, некоторые белки могут по своей сути быть непригодными для производных с I3C. Места связывания I3C на белках зависят от структуры белка. Там могут существовать белки, которые, естественно, имеют несколько открытых патчей совместимы с I3C связывания. Таким образом, не предвидится, что могут возникнуть трудности в совместной кристаллизации некоторых целевых белков с I3C. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Ширвина и Брунинга за обсуждение этой работы. Авторы также хотели бы отметить д-ра Сантуха Панджикара и д-ра Линду Уайтт-Шервин, которые внесли свой вклад в первоначальную работу, которая стала инициатором этого протокола. Признается следующее финансирование: Австралийский исследовательский совет грант Nos. Ширвин ; Университет Аделаиды Австралийская государственная программа подготовки научных исследований стипендию стипендию Цзя Куйен Труонг и Стефани Нгуен. Truong, J. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Biochemistry. Экспериментальное планирование и соображения Используйте уже существующие кристаллы белка, представляющие интерес, предпочтительно генерируемые путем кристаллизации диффузии пара. Для обобщенного протокола кристаллизации диффузии пара см. Другие методы кристаллизации, такие как микробэтч под маслом и свободное распространение интерфейса потребует сбора кристаллов до дробления для получения микросея. При приготовлении семенного запаса используйте кристаллы высочайшего качества, которые можно принести в жертву. Кристалл высочайшего качества можно судить визуально на основе морфологии или лучший кристалл диффрактинга может быть выбран, если такие данные доступны. Весьма вероятно, что еще более качественные кристаллы получаются после оптимизации путем посева. В случае, когда нет кристаллов доступны, кристаллические осадки, такие как сферулиты и иглы могут быть использованы. Определите кристаллы соли. Кристаллы соли могут расти в кристаллизации экранов и может выглядеть как кристаллы белка. Использование кристаллов соли в rMMS не принесет никакой пользы и будет тратить драгоценные образцы, поэтому важно, чтобы устранить соль ложных срабатываний. Кристаллы соли громки, когда они раздавлены. Кристаллы должны быть измельчены для создания семенного запаса, поэтому эта стратегия особенно актуальна. Если слышен звук трещины при дроблении кристаллов, кристалл, скорее всего, соль. Если белок содержит триптофан и тирозин остатки, используйте ультрафиолетовую микроскопию флуоресценции для выявления кристаллов белка, которые флуоресце в этих условиях освещения. Используйте изитовый краситель метиленовый синий для окрашивания кристаллов белка, чтобы дифференцировать их к кристаллам соли, которые остаются относительно неокрашенными. Тем не менее, эта процедура является более разрушительной и рекомендуется только в том случае, если есть кристаллы, чтобы избавить от репликаций той же капли. В этом случае эксперименты по дифракции могут быть использованы для окончательного различевания белка и кристалла соли. Подготовка литиевого запаса I3C Измерьте мг I3C 5-амино-2,4,6-трийодуазофталовая кислота в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Раствор можно аккуратно нагреть с помощью теплового блока при температуре градусов по Цельсию, чтобы стимулировать растворение. Полученный раствор лития I3C должен быть коричневым и иметь концентрацию 1 М. Следует надеть защитные очки, перчатки и лабораторное пальто. Измерьте рН раствора. При необходимости добавьте небольшое количество соляной кислоты 1 М или 2 М гидроксида лития, чтобы настроить рН до Добавьте миллиз воды, чтобы сделать окончательный объем раствора до мл. Концентрация биржевого раствора I3C составляет 0,5 М. РН раствора должен быть между рН до любой регулировки рН. Этот шаг должен быть выполнен, если белок интереса сильно зависит от рН. Протокол можно приостановить здесь. Литий I3C может храниться в темноте при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере две недели Окончательная концентрация должна быть между мМм лития I3C. Метод 2 более мягкий метод Подготовье буфер разбавления белка, который соответствует буферу целевого белка. К этому буферу разбавления добавьте запас лития I3C, чтобы дать концентрацию лития I3C между мМ. Разбавить белок буфером разбавления белка, чтобы дать окончательную концентрацию лития I3C между мММ. Метод 2 снижает вероятность осадков. Тем не менее, этот метод вдвое концентрации белка. Рекомендуется первоначальное соотношение моляров I3C к белку 8. Концентрация белка и соотношение моляров I3C к белку могут быть оптимизированы после первоначального экрана. Изготовление семенного запаса Сделайте округлый зонд для дробления кристаллов. С горелки Bunsen на синем пламени, тепло Пастер пипетки к его середине. Используя пинцет, вытяните конец пипетки Pasteur, чтобы вытянуть ее в тонкий диаметр менее 0,3 мм. После того, как животик достаточно тонкий, удерживайте этот сегмент в пламени, чтобы отделить пипетки в этой точке и вокруг конца пипетки, чтобы закончить стеклянный зонд. Это альтернатива созданию округлых зондов. Поместите на лед пять микроцентрифуговых труб 1,5 мл. Под световым микроскопом изучите лоток кристаллизации для подходящего состояния для генерации микрокристалл. В идеале выбираются хорошие морфологии больших кристаллов. Тем не менее, этот метод также работает с плохими кристаллами морфологии, иглы, пластины, микрокристаллы и сферулиты. Откройте кристаллизацию лоток хорошо. Для 96 хорошо кристаллизации лотки запечатаны пластиком, используйте скальпель, чтобы сократить пластиковые уплотнения хорошо. Для висячих лотков капли запечатаны с жиром, coverslip могут быть удалены с помощью пинцета и перевернутый на ую поверхность. Перенесите 70 МКЛ раствора резервуара в микроцентрифугную трубку и охладите ее на льду. К другим трубам микроцентрифуга добавьте 90 МКЛ раствора резервуара и вернитесь во льду, чтобы охладиться. Агитировать кристалл в падении с помощью кристаллического зонда, чтобы тщательно раздавить его. Кристалл должен быть полностью раздавлен, который можно контролировать под микроскопом. Удалите всю жидкость из капли и перенесите ее в трубку микроцентрифуга раствором резервуара. Смешайте и затем возьмите 2 мкл смеси из микроцентрифуг трубки и добавить его обратно в колодец. Промыть колодец раствором и перенести его в трубку микроцентрифуга. Повторите этот шаг полоскания еще раз. С этого момента, держать микроцентрифуг трубки холодной, чтобы избежать таяния микросея в смеси. Vortex трубки на максимальной скорости при 4 градусов по Цельсию в течение 3 минут, останавливаясь регулярно, чтобы охладить трубку на льду, чтобы предотвратить перегрев. Мы использовали технику без использования семенного шарика с успехом, но не видим никаких проблем с использованием семенного шарика, чтобы раздавить кристаллы. Сделайте 1 из 10 серийного разбавления семенного запаса путем последовательной передачи 10 йл между охлажденными растворами резервуара. Храните запасы семян, которые не будут использоваться сразу при градусов по Цельсию. Настройка экрана rMMS Настройка 96 хорошо скрининг пластины с помощью жидкости дозирования робота. При отсутствии робота можно также использовать многокананеловую пипетку. Передача 75 йл из глубокого блока хорошо 96 хорошо кристаллизации лоток. Добавьте 1 йл к падению кристаллизации и 74 МКЛ к резервуару. Передача 1 мл белка, дополненного литием I3C, сделанного в шаге 2, к падению кристаллизации. Передача 0,1 МЛ семенного запаса в каплю кристаллизации. Печать пластины с ясной уплотнительной лентой и инкубировать пластины при постоянной температуре, чтобы кристалл роста. Настройка висячих экранов капли Смазать края висячих колодцев капли висящие лотки кристаллизации капли можно найти в 24 и 48 форматах скважины. Перенесите раствор кристаллизации МКЛ в резервуар. Рядом с центром стеклянной крышки слайд, место 1 йл капли белка, дополненного лития I3C, сделанные в шаге 2. Добавьте к капле 1 мл раствора кристаллизации. Инвертировать крышку слайда и печать кристаллизации хорошо, нажав крышку слайд в жир. Инкубировать пластину при постоянной температуре, чтобы обеспечить рост кристалла. Последующие условия могут быть созданы с пониженной концентрацией семян для оптимизации количества кристаллов. Регулярно проверяй кристаллические подносы под микроскопом на кристаллический рост. Если кристаллы имеют достаточное качество, они могут быть собраны для сбора данных. Кристаллы также могут быть использованы для создания новых запасов семян и новых экранов rMMS, чтобы обеспечить итеративную оптимизацию. Сбор данных Урожай кристаллов с помощью криолупов, криопротезатор кристаллов и вспышки охладить их в жидком азоте. Для получения дополнительной информации о кристаллах флэш-охлаждения, обратитесь к Teng 37 и Гарман и Митчелл Во время стадии криопротезирования, если кристалл проходит через новый aqueous раствор, I3C может быть потерян из кристалла из-за его пиявки в раствор криопротезирования. Используйте литий I3C в растворе криопротекторной раствора в концентрации, которая соответствует условию кристаллизации, чтобы смягчить это. Кристаллы, выращенные с помощью этого протокола, успешно были криопротезированы с помощью криопротектора на основе масла Parabar Hampton Research. Кроме того, жидкий азот может вызывать удушье при использовании в закрытых помещениях. Накрените кристалл на рентгеновский источник гониометра и соберите данные дифракции с помощью протокола, специфичного для рентгеновского источника. Этот метод опирается на аномальный сигнал от атомов йода в I3C. Таким образом, выберите энергию рентгеновского излучения, чтобы максимизировать этот сигнал. Установите синхротронные рентгеновские источники с настраиваемыми энергиями как можно меньше. Для многих макромолекулярных кристаллических лучей самая низкая настраиваемая энергия составляет от до эВ. Вращающиеся рентгеновские источники анода не могут быть настроены. Обычно используемые источники анода с медью имеют край КЗ на уровне eV, который обеспечивает хороший аномальный сигнал для йода f' 6,9 e. Источники анода с хромом имеют край КЗ на уровне эВ, который обеспечивает большой аномальный сигнал для йода f' 12,6 e. Радиационный ущерб является серьезной проблемой при сборе данных, так как он ухудшит аномальный сигнал Выберите время облучения и затухание луча для достижения наилучшей дифракции при минимизации дозы облучения. Используйте обратный луч SAD сбора данных в качестве стратегии сбора. Данные собираются в клинья, с противоположными клиньями, собранными друг за другом. Это позволяет собирать пары Фриделя с эквивалентной дозой, что приводит к улучшению измерения аномального сигнала, менее пострадавшего от радиационного повреждения. Для недавнего сравнения стратегий сбора, см. Гарсия-Бонте и Катона Решение по обработке и структуре данных Выполняйте снижение данных по данным дифракции с помощью XDS 41 с целью максимизации аномального сигнала. Параметры ввода снижения данных специфичны для набора данных и могут потребовать некоторых проб и ошибок. Вот некоторые рекомендации, чтобы начать. Один запуск может иметь более высокий аномальный сигнал, чем другой. Сравните аномальные сигналы между трассами с использованием дисциплин «Аномалия Корр» и «СигАно» на выходе. Это обеспечивает показатель качества данных. Файл HKL для более точного указания аномального сигнала. Дисциплина «Раном» даст представление об аномальном сигнале в разных разрешениях. Если используется графический интерфейс, выберите опцию Отдельные аномальные пары для отклонения выбросов и слияния статистики. Для максимального аномальных сигналов может потребоваться тестирование различных разрешений. Решите структуру белка с помощью Auto-Rickshaw автоматизированной кристаллической структуры определения трубопровода Авто-рикша будет пытаться решить проблему фазы и построить кристаллическую структуру белка автоматически с белкового моделирования и уточнения программного обеспечения. Для белков без шаблона модели гомологии запустите протокол SAD Auto-rickshaw в расширенном режиме. Введите необходимые параметры. Введите длину волны сбора данных в ангстремах Я. Выберите 'I' в качестве элемента подструктуры для обозначения атомов йода. Выберите 'i3c' в качестве подструктурного типа, чтобы указать, что I3C является фазированной молекулой. Выберите '3' в качестве числа ожидаемых подструктур на мономер. Введите '1' в качестве разрешения отсечения подструктуры поиска. Это позволяет Auto-rickshaw автоматически определить подходящее разрешение отсечения. Введите количество остатков в одном мономере, космическую группу набора данных и количество молекул в асимметричном блоке на основе коэффициента Мэтьюса. Выберите соответствующий уровень распространения рентгеновских данных, который соответствует потребностям. Выбор 'AutoRickshaw разработчиков' позволит разработчикам Auto-Rickshaw устранения неполадок в случае возникновения проблем. Вввеку аномальные данные в качестве файла mtz. Вввейте белковую последовательность в качестве файла seq, pir или txt. Файл seq может быть сгенерирован в текстовом редакторе например, Notepad 9 на Windows или nano в Linux. Создайте новый файл, введите первичную последовательность белка в качестве одной длинной линии или разделенных разрывами линий. Сохраните файл с расширением файла. Введите институциональный адрес электронной почты. Результаты доставляются через веб-ссылку, отправленную на предоставленный адрес электронной почты. Если запуск Auto-Rickshaw не решает структуру, другие настройки Auto-rickshaw могут быть протестированы. Число ожидаемых подструктур на мономер также может быть увеличено или уменьшено. Во время экспериментального поэтапного отказа от кристаллической структуры, Auto-rickshaw попытается позиционировать тяжелые атомы в ячейке единицы, создавая подструктуру. Равностороннее расположение атомов йода в I3C представляет собой эффективный способ проверки подструктуры. Если шаг 6. Скачать список тяжелых атомов сайтов из Auto-Рикша результаты страницы. Это гиперссылка называется 'тяжелых атомных участков'. Это будет скачать текстовый файл с тяжелым атомом сайтов. Измените расширение файла с. Откройте файл PDB в Кут Включите симметрию, чтобы увидеть другие тяжелые атомы из соседних асимметричных единиц. Измерьте расстояния между тяжелыми атомами, в том числе через асимметричные единицы. I3C будет отображаться как равносторонний треугольник с боковой длиной 6 ангстремов. Наличие треугольника с этими измерениями указывает на правильность размещения этих тяжелых атомов. Play Video. Cite this Article Truong, J. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.