Бангкок купить LSD 220 mkg

🔥Мы профессиональная команда, которая на рынке работает уже более 5 лет.

У нас лучший товар, который вы когда-либо пробовали!

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ (ЖМИ СЮДА)<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

_______________

ВНИМАНИЕ! ВАЖНО!🔥🔥🔥

В Телеграм переходить только по ССЫЛКЕ что ВЫШЕ, в поиске НАС НЕТ там только фейки !!!

_______________

Бангкок купить LSD 220 mkg

Хуа Хин Таиланд Купить Героин, Кокаин (VHQ, HQ, MQ, первый, орех), Метадон, Марки (ЛСД 25)

Бангкок купить LSD 220 mkg

Закладки мефедрона Марса Алам

Купить Метамфетамин Кириллов

Бангкок купить LSD 220 mkg

Юрюзань купить Гашиш [AB]

Цель этого метода заключается в содействии быстрый, чувствительной и конкретных обнаружения вируса тилапии озеро TiLV в тканях тилапии. Этот протокол может использоваться в рамках программ наблюдения, мер по обеспечению биозащищенности и в TiLV основных исследовательских лабораториях. Золотым стандартом диагностики вируса обычно включает изоляции вируса, следуют дополнительные методы, такие как обратное транскрипция полимеразной цепной реакции ПЦР для дальнейшей проверки. Это может быть громоздким, времени и обычно требует образцов тканей, сильно заражены вирусом. Из-за его количественный характер, высокая чувствительность, специфичность, масштабируемость и его быстрое время, чтобы привести выгодно использование количественного RT-PCR q для обнаружения вирусов. Последний подход позволит абсолютной количественной оценки TiLV вниз как 2 копии и таким образом является исключительно полезным для диагностики TiLV в югу клинических случаях. Подробное описание двух подходов PCR, представитель результаты из двух лабораторий и тщательное обсуждение критических параметров обоих были включены обеспечить, что исследователи и диагносты найти их наиболее подходящим и применимым метод обнаружения TiLV. Поставка рыбы глобальной душу достиг новой записи 20 кг в году, и это было вследствие энергичного роста в аквакультуре. Аквакультура остается одним из наиболее быстро растущих животных продуктов питания производство секторов во всем мире и является сектор только животных производства продовольствия, которое растет быстрее, чем население 1. Tilapiine cichilds составляют второй наиболее важный пресноводная рыба, выращиваемых во всем мире с общего глобального производства 6,4 миллиона тонн МТ и предполагаемое значение 9,8 млрд долларов США в году 2. Топ 10 производителей тиляпии являются Китай 1,78 MT , Индонезия 1. Ожидается, что глобальная тилапии производство будет около 7,3 MT 3. Тилапии стали таким важным глобальным источником пищи, не только потому, что они являются недорогой источник белка 4 , но и потому, что они легко размножаются в емкость под широкий спектр водных и климатических условий 5 , 6. Всего лишь несколько десятилетий назад, считалось, что там было несколько коммерчески значимых заболеваний угрожает тилапии земледелия, но это больше не так. Новые вирусная болезнь под названием тилапии озеро вирусных заболеваний TiLVD — первый когда-либо критического заболевания эпидемии в тилапии и вся промышленность находится в опасности. Эта болезнь имеет серьезные социально экономические последствия и представляет собой прямую угрозу для продовольственной безопасности для миллионов людей в Африке 7 , Азии и Южной Америке. В начале Всемирной организации по здоровью животных МББЭ сообщил, что этиологический агент этого заболевания, TiLV, было официально выявлено на трех континентах, охватывающий восемь стран 8 , и поскольку этот возбудитель информационная карточка Обновление там были больше сообщения о TiLV в Танзании, Уганда 9 , Индонезия 10 , Тайвань 11 и Перу TiLV — Роман одноцепочечной РНК вирус описанных быть orthomyxo как вирус, потому что он содержит целый ряд характеристик напоминают другие orthomyoxoviruses, таких как грипп или инфекционный лосося анемии вирус ISAV Она была впервые выявлена в результате массовые потери диких и выращиваемых тилапии в озеро Кинерет, Израиль Впоследствии аналогичные вспышки заболеваний, упоминаемые как летняя смертность и один месяц, синдром смертности, связанные с TiLV инфекцией сообщалось в Нил тилапии Oreochromis niloticus в Египте 15 и Нила и красных гибридных тилапии Oreochromis sрр. Исторически обнаружение водных животных вирусов осуществляется роста и изоляции вируса в культуре клеток. В то время как вирус культура имеет то преимущество, что она предоставляет материал для дальнейших экспериментов, он имеет тот недостаток, что он требует по крайней мере дней, чтобы наблюдать за формирование цитопатического воздействия CPE и критически, piscine различные вирусы, которые больше подходят для Репликация может быть унаследован и производить аналогичные CPE. В последние несколько десятилетий наблюдается отход от традиционных, зачастую много времени методы диагностики как культуру клеток, серологии и обнаружения антигена и замена с быстрее и более чувствительных нуклеиновой кислоты на основе обнаружения испытаний 20 , Это становится очевидным тот факт, что многие анализы ПЦР были разработаны как важные диагностические методы для множества вирусных заболеваний водных животных, таких как для ISAV 22 , 23 , вирусная геморрагическая септицемия вирус VHSV 24 25 , , betanodavirus , 26 27 лососевых альфавирус 28 , рыбы iridovirus 29 , Anguillid герпеса 1 AngHV1 30 и Lymphocystis болезни вирус НКУ Надежные методы для диагностики и возбудителя наблюдения необходимы для уменьшения распространения TiLV. Такие методы должны позволить раннего обнаружения инфекции, прежде чем разработать клинические признаки и низкой вирусной нагрузки. Хотя каждый опубликованный протокол PCR разные чувствительности для обнаружения TiLV, большинство анализов являются весьма чувствительными с пределов обнаружения вирусных копий на 7,5 копии 33 , 7 копий 18 или 2 копии 32 в реакция. Первая менее чувствителен, но обычно является более дешевый вариант обнаружения. Последнее требует более сложной инфраструктуры, например Количественная ПЦР машины и дороже реагенты, но она имеет преимущества количественных, быстро и чувствительный, означает, что он может использоваться для обнаружения TiLV в суб-клинически зараженной рыбы. Примечание: Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы для расширенной информации, касающейся реагенты и оборудование, предложенные для этого протокола. Таблица 1. Грунтовка, набор отображается жирным шрифтом были использованы для создания представительных результаты, показанные на рисунке 3A и 3B. После протокол, описанных в разделе 1 умирающий красных гибридных тилапии, отображение клинические признаки инфекции TiLV рис. Брюшной стенки был удален для сбора внутренних органов, как печень, селезенка или головы почек рис. Слизь образцы были также собраны на этой стадии нежно очищая кожу от передней к задней рыбы с помощью покровным стеклом или хирургическое лезвие Рисунок 1. Диссекции и образец коллекции тилапии. TiLV инфицированных красных гибридных тилапии с leisons кожи, покраснение вокруг рта и крышечки, эрозии кожи и прозрачность роговицы. Sectioned красных гибридных тилапии для коллекции тканей печени точке синяя стрелка , селезенки или органов головы почек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. После этого последовали протокол, подробно изложены в разделе 2 для извлечения Guanidium тиоцианат-фенол-хлороформ всего РНК и РНК количественной оценки, как указано в разделе 3 была выполнена для оценки чистоты образца расчет соотношений чистоту и исследование спектральных профилей рис. Нуклеиновые кислоты имеют максимумы поглощения на а белки их на nm. Отношение измерения на Нм и Нм указывают чистоту каждого образца и соотношения 1,9 до 2,1 указывают чистой РНК, как в случае для примера на рисунке 2A. Это отношение должно быть в диапазоне 2,,2 для чистой РНК препараты как показано значение 2. Для примера, показано на рисунке 2B , повторно вызовет РНК для удаления загрязнения может улучшить чистоты образца. Рисунок 2. Спектрофотометрические количественной оценки общего РНК, извлеченные из тканей больного тилапии. Коэффициенты чистоты и спектральные профили от успешной подготовки РНК. Грунты, показано жирным шрифтом в таблице 1 были использованы для того чтобы усилить bp фрагмент TiLV геномной сегмент 3 Продукты PCR были отделены электрофорезом геля и витражи с бромистый этидий для визуализации. На рисунке 3A показывает результаты двухэтапный RT-PCR с использованием 4 cDNA выборок S1-S4 , производные от печени пораженной тилапии, изолированных в Таиланде и в каждой пробе, чистой однодиапазонный приблизительно bp может наблюдаться и таким образом, образцы TiLV положительный. Проба на рисунке 3B проводилось с использованием же грунты, как показано на рисунке 3A , но в другой лаборатории, используя одноэтапный подход RT-PCR и с 5 РНК образцов, полученных из головы почки тканей тилапии, происходящих в египетских аквакультуры Негативный контроль, включая два минус управления обратной транскриптазы и два фнт сделал не создает каких-либо продуктов ПЦР. Ампликон размер bp был сгенерирован в каждом образце S1-S5 как ожидаемый Этот assay служил в качестве элемента управления для обеспечения целостности образцов РНК, а также позволяет для полуколичественного анализа позитивных образцов TiLV. Учитывая, что сгенерированный тилапии ActB продукт является относительно равных, различия в размере TiLV конкретного ПЦР продукта создается может интерпретироваться как подлинное отражение количество TiLV в образец данной ткани. Рисунок 3. Элементы управления C1-C2 минус элементы управления обратной транскриптазы и C3-C4 фнт. В отличие от конечной точки PCRs, представлены на рис. Амплификация ДНК целевой обнаруживается с помощью флуоресцентных молекул, которые взаимодействуют с ДНК, созданный из каждого раунда реакции. Флуоресцентного сигнала следует во время реакции и его интенсивность относится к количество продукта формируется 39 , 40 , , 41 42 , В результате усиления кривых показано в рисунке 4A и 4B. Можно отметить, что для калибровочных, ход эксперимента имеет четыре фазы: этапа линейной земли, ранней экспоненциальной фазе, конце экспоненциальная фаза и фаза плато. Базовые флуоресценции вычисляется во время этой фазы. После этого цель ДНК начинает двойной концентрации с каждым циклом, вызывая сигнал стать обнаруживаемая выше фона и возрастать по экспоненте. В более поздних циклах сигнал начинает плато, и интенсивность флуоресценции больше не коррелируется с стартовый номер копии шаблона, потому что компоненты реакции в исчерпаны Насыщение может также возникать из-за конкуренции со стороны вновь отжига реакции, изменение соотношения концентрации компонентов, или количество единиц фермента ДНК молекул субстрата. Возможно такие параметры учитывать различия между амплификации кривых для анализов, показано на рисунке 4A и 4B. Включить элементы управления не создает эти характерные амплификации кривых. Рисунок 4. Усиления участков Показать накопление продукта с длительностью в реальном времени анализа ПЦР. График был создан путем построения относительной флуоресцирования РФС vs. Амплификация кривая является флуоресценции репортер сигнала, нормализуются к флуоресцирования пассивного ROX краситель, включены в Пробирной Rn против номер цикла. В конце thermocycling ПЦР на различных машинах в каждой лаборатории данные были приобретены и проанализированы. Рисунок 5А и 5B показать представителя плавления кривых из анализов, выполненных в каждой лаборатории. Каждая машина ПЦР был запрограммирован для анализа в конце плавки кривой. Это было достигнуто путем постепенного повышения температуры и мониторинга флуоресценции как функция температуры. Когда температура достаточно высока, чтобы денатурировать dsDNA, большая капля в флуоресцировании записывается потому что выпущен молекулы Флюорофор. Программное обеспечение каждого инструмента ПЦР рассчитывается отжига температура T m от плавления кривой данных путем построения негативные первой производной против температуры рис. Были замечены другие пики, при более низких температурах. Из-за их малого размера T m грунт-димеров обычно ниже, чем у целевого объекта последовательности ДНК. Таким образом эта разница между T m делает его легким для определения потенциальных грунт димеры или других продуктов амплификации неспецифической. Элементы управления не создают расплава кривые, как TiLV положительных образцов и стандартов и может рассматриваться как почти горизонтальной линии в нижней части диаграммы в Рисунок 5А и 5B. Рисунок 5. Расплава анализа кривой для обеспечения анализа специфики и различных продуктов ПЦР могут быть продифференцированы их плавления черты. Графики в A и B оба показывают изменения в флуоресцировании, деленное на изменения температуры заговор против температуры производить четкую картину динамики плавления. Большинство ПЦР машины поставляются с программного обеспечения содействия дальнейшей оценки ПЦР запуска и будет количественно образцы, создавая калибровочной кривой, автоматически заговоре против логарифм pTiLV стандартов шаблон цикла порога t C скопируйте номер, как показано на рисунке 6A и 6B для двух независимых лабораторий. Вкратце C t является единица, используемая для оценки результатов ПЦР. Значение t C обозначает количество циклов, необходимых для достижения установленного порогового уровня сигнала флуоресценции. Чем больше количество начиная шаблон, тем меньше циклов он принимает для достижения уровне обнаружению флуоресценции. Действительно образцов с высокой нагрузкой TiLV будет иметь более низкие значения t C чем образцы с низкой нагрузкой TiLV таких как в рыбе с субклинический инфекции. Чтобы определить значения t C, фоновые уровни флюоресценции, сначала вычитаются из необработанных данных. Далее программное обеспечение, связанные с устройством ПЦР автоматически выберет флуоресценции порог путем поиска данных кривые для каждого образца и включения C t , представляющий, где образца переступив порог. Это делается отдельно для каждого пробирного и необходимо тщательно анализировать каждый порог, обеспечивая, что порог был создан в части логарифмических кривых амплификации и в месте, где все кривые являются параллельными. Таким образом конкретные C t приобрела является относительное значение и это относительно отправной шаблон копирования номер 45 , но это также специфически для ПЦР машины и реагенты используемые, эффективности амплификации PCR и чувствительность обнаружения. Эти параметры способствуют различия, используя же пробу на рисунке 6. Калибровочной кривой анализа также использовались для подтверждения чувствительность предел обнаружения , повторяемости и воспроизводимости assay. Однако на практике такой идеальной эффективности редко достигается благодаря югу оптимальные условия PCR например, ингибирования ДНК-полимеразы, загрязнений, слишком много cDNA и закупорить ошибки Линейный регрессионный анализ стандартных участка также позволяет для расчета числа TiLV копий в каждом образце 41 , 42 , 45 , как можно наблюдать для трех образцов TiLV показано красным в Рисунок 6B который соответствует результаты для образцов S1 и S3, S5, показано на рисунке 3B. Рисунок 6. RT-ПЦР стандартных кривых. Калибровочной кривой был создан путем построения журнала копии номер против цикла порога t C. Для обоих стандартов кривых в A и B, наклон и y пересечение значения коэффициента корреляции R 2 используются для анализа производительности assay. Важно отметить, что значение R 2 должна быть близка к 1, так как это мера линейность калибровочной кривой. TiLV впервые сообщалось в году в Израиле 14 и с тех пор, она была обнаружена в нескольких странах, включая Египет, Колумбия, Индия, Малайзия, Уганда, Танзания и Таиланд 15 , 16 , 18 , 35 , Существуют различные аспекты этих методов, которые требуют конкретного обсуждения. TiLV была обнаружена в рыбе, охватывающих различные размеры 9 , 12 , 14 , 15 , 49 и виды тиляпии до настоящего времени, включая выращиваемых гибридные тилапии O. Образцы ткани из внутренних органов Гилл, селезенка, печень, сердце, голову почек или слизь 37 можно собранные как здоровых, так и умирающий тилапии независимо от возраста, размера или вида и обрабатываются для изоляции РНК. Общая РНК добыча протокол изложенные здесь использует монофазные раствор фенола и Гуанидиновые тиоцианат, который является агентом денатурируя chaotropic. Ткани непосредственно гомогенизации в этом решении, с последующим добавлением хлороформе и центрифугирования для достижения разделения этап которой генерируется ясно РНК, содержащие верхние водной фазе, интерфаза и Нижняя органические фазы. РНК изолирован от водной фазе высыпанием изопропиловый спирт, после мытья восстановленные РНК избавиться от загрязнений. Изоляция РНК по этой методологии было pioneered Петр Chomczynski и Николетта Sacchi и был передан как Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ извлечения 53 , Этот тип реагент, который используется для извлечения РНК может быть коммерчески приобрели или в лаборатории см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации. Этот протокол занимает немного больше времени, чем методы, основанные на столбце, например очистки на основе силики, но в целом, он является более экономически эффективным и дает более РНК. Хотя этот метод даст хорошее представление о образец чистоты, он не может абсолютно сообщить о качестве извлеченного РНК. Правильно определить, является ли РНК нетронутыми или частично деградировавших, образцы могут быть разделение электрофорезом геля агарозы которой размытие бромистый этидий окрашенных 18S и 28S рРНК полосы указывают РНК деградации. Дальнейшей проверки качества РНК могут включать в себя с помощью инструмента лаборатории на чипе. Кроме того, это также важно усвоить очищенный РНК с DNase I для удаления загрязнения принимающей геномной ДНК, который в зависимости от нисходящие приложения может привести к ложным результатам. Таблицу материалы. Дополнительные синтеза ДНК может сильно повлиять на общие результаты ПЦР и является аспектом метода, который могут внести изменения. Протокол cDNA, выступает здесь состоит из одного компонента установки с помощью oligo dT и таким образом только транскрибирует мРНК, содержащие поля хвосты. Это позволяет точно какие компоненты для использования в реакции обратной транскрипции и этот режим cDNA синтез оказался успешным для обнаружения TiLV 32 пользовательский элемент управления. Альтернативой этой настройки является коммерчески купил Мастер микс содержащие все компоненты, необходимые для обратной транскрипции реакции и очень быстро и просто без обычных многоступенчатый, дозирования и температурными протокол. Это выгодно, потому что он сводит к минимуму обработку и способствует единообразия во всех образцах. Эта универсальность является главным преимуществом 2-шаг ПЦР подхода; Она обеспечивает долгосрочный бассейн, который может использоваться для многих различных экспериментов. В общем последовательность конкретных грунтовки позволяют для более высокой эффективности RT конкретные цели РНК, чем использование случайных грунтовки, но конкретных целевых РНК является единственной, которая может быть определена количественно в такой образец cDNA, которая может быть единственной целью некоторых лабораторий см. Таблица материалов для синтеза cDNA продукта предложения. RT-ПЦР было показано, чтобы быть более мощным инструментом для выявления и количественной оценки небольших количеств TiLV в тканях рыбы или слизь 32 , В общем ПЦР широко используется в клинической вирусологии диагностических лабораторий из-за его высокую чувствительность, специфичность, хорошая воспроизводимость, широкий динамический диапазон и скорость Этот последний момент означает, что существует минимальный риск для лабораторных загрязнения, и она может быть легко адаптирована к высок объём ситуаций таких, как в случае вспышки. Кроме того это по сути более чувствителен, чем обычные RT-PCR, который имеет жизненно важное значение для выявления низкой вирусной нагрузкой в субклинический инфекции Это потребует вложенных ПЦР подход, требующий обратной транскрипции, два дальнейших реакциях PCR и затем анализ агарозы электрофорез геля. Эти многие шаги занять много времени и увеличить шансы на ошибки или загрязнения. Тем не менее из-за его высокой чувствительности, RT-ПЦР требует тщательной экспериментальной разработки и глубокого понимания методов количественной оценки для генерации точных результатов 56 , Это dsDNA неспецифических ДНК связывание красителя, и таким образом специфика assay полностью лежит в наборе грунты, которые может создавать ложных срабатываний Таким образом, в то время как dsDNA плавления выполняется в конце каждого ПЦР анализа кривой является особенно важной частью реакции PCR, потому, что он подтверждает, что только один Ампликон ПЦР правильную т м производится это должно также достигаться путем гель электрофорез, когда реализуются новые анализы. T m фрагмента ДНК зависит целый ряд функций, таких как его длина, GC композиция, последовательности, взаимодополняемости прядь, а также концентрация буфера компонентов и ПЦР усилители. Несомненно грунты, предназначенные для RT-ПЦР-анализов имеют основополагающее значение для успеха пробирного и грунты здесь были разработаны основанные на общедоступных геномных данных TiLV на время Однако РНК-вирусов хорошо известны высокой мутации темпы и возможных штаммов будет избежать текущих диагностические тесты, как было отмечено для ISAV Он всегда будет трудно для таких типов вируса для создания универсальной Пан TiLV RT-ПЦР анализа и такие анализы будут только постоянно совершенствоваться если больше TiLV геномных данных из далеко идущих мест и периодов времени. Наконец крайне важно для выполнения повторяющихся или если возможно, тройные реакции в обоих intra и Интер анализы ПЦР. Если значения t C очень высоки, то использование реплицирует это особенно важно, чтобы удостовериться, что реакция PCR надежных и воспроизводимых. Использование интегрированных ПЦР дозирования робота помогает больш с этим вопросом, но это роскошь инструмент. Как с любой эксперимент, включение адекватные и соответствующие элементы управления имеют первостепенное значение для развития надежных молекулярные анализы, особенно в диагностических лабораториях, где такие анализы должны быть аккредитованы. Такие элементы управления нельзя недооценивать и должны быть включены в калибровочных правильно понять качество каждого шага анализа и правильно интерпретировать результаты. Мы благодарны института ветеринарной бактериология, Vetsuisse факультет, Университет Берн за их поддержку. WS и PR поддерживаются центр перспективных исследований для сельского хозяйства и продовольствия, Институт продвинутых исследований, Университет Касетсарт, Бангкок, Таиланд под высшего образования поощрения исследований и национальных исследований университета проект Таиланда, офис Высшее образование Комиссии, министерства образования, Таиланд. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Kwanrawee Sirikanchana для своего повествования и Piyawatchara Sikarin для редактирования видео. Nicholson, P. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Environment. Примечание: Tricaine Метансульфонат MS может использоваться вместо гвоздичное масло. Найти печени и отрезать кусочек примерно мг или собирать мкл слизи, с использованием стекла или хирургическое лезвие для удаления слизи из предшествовавшие задней рыбы тиляпии и поместить образцы в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Добыча и изоляции всего РНК из клеток ткани требует тщательного лабораторного техника; принять все положения для предотвращения загрязнения РНКазы носить перчатки, используя РНКазы свободной воды, реагентов, оборудования, пластиковая посуда, посуда, рабочее пространство и используя фильтр советы для пипетирования. Guanidium тиоцианат - фенол - хлороформ добыча РНК Добавьте 1 мл раствора монофазных, содержащих фенол и гуанидина Изотиоцианаты в пробирку, содержащую образец ткани из раздела 1. Предупреждение: Это решение весьма токсичен и должны быть обработаны с осторожностью в Ламинарный шкаф с защитным оборудованием и надлежащие защитные очки, Одежда и защитные перчатки. Измельчить образец ткани, с использованием гомогенизатора пестик ткани до однородной. Примечание: Образцы можно также гомогенизированные с использованием гомогенизатора мощности, в сочетании с керамической дробью. Его следует подходить с осторожностью в Ламинарный шкаф с защитного снаряжения, а также надлежащие защитные очки, Одежда и защитные перчатки. Как менее токсичны альтернативных, 1-бромchloropropane может также использоваться. Примечание: Масштаб тома вверх или вниз, где это уместно. Например если только мкл раствора монофазных, содержащих фенол и гуанидина Изотиоцианаты было использовано, то только мкл метилхлороформа на этот шаг. Mix образцы хорошо инверсии для 15 s. Проинкубируйте образцы 3 мин при комнатной температуре RT. Примечание: Там должно быть четкое разделение на нижней органические фазы, белый межфазной и верхняя водной фазе, содержащие РНК. Этот верхний этап обычно бесцветен, но в зависимости от типа и количества гомогенизированные ткани, она может иметь вид светло розовый. Не нарушая интерфаза передать свежие microcentrifuge трубки верхний водный слой примерно мкл. Примечание: не пытайтесь перевести весь водяной участок, оставить небольшую сумму, чтобы не допустить любого потенциального загрязнения РНК, содержащие водной фазе с органических или межфазное. При необходимости если использовались очень небольшое количество ткани, затем добавьте 1 мкл мкг бесплатно РНКазы гликогена для каждого образца для поощрения эффективных осадков РНК. Это поможет определение РНК Пелле в шаге 2. Смесь хорошо, инверсии трубы несколько раз. Выбросите супернатанта, соблюдая осторожность, чтобы не вытеснить Пелле РНК в нижней части пробки microcentrifuge. Выбросите супернатанта, быть бдительным, чтобы не вытеснить Пелле РНК в нижней части пробки microcentrifuge. При необходимости повторите шаги 2. Тщательно мытья РНК Пелле сведет к минимуму любой соли или переноса загрязняющих веществ, которые могут помешать будет чувствительных нисходящие приложения. Вытянуть остальные этанола, с помощью пипетки и затем просушите Пелле РНК при комнатной температуре не более мин. Примечание: Чрезмерное сухие гранулы будет трудно вновь приостановить. Используйте мкл РНКазы свободной воды как пустой. Записать показания на Нм, Нм и Нм для каждого образца. Для этого подготовьте RT-Мастер микс соответствии количество образцов и элементов управления для проверки. Примечание: Элементы управления являются образцом минус обратной транскриптазы -RT которой RT фермента заменяется нуклеиназы свободной воды см. Смешайте образцы хорошо закупорить следуют краткие центрифугирования. Кратко Центрифугуйте образцы собрать все жидкости в нижней части трубы. Добавить 1 x обратной транскриптазы буфера, U обратной транскриптазы и довести окончательный объем каждого образца до 20 мкл, с использованием воды, свободной от нуклеиназы. Положительный контроль, если таковые имеются, должны быть также включены, включающий предпроверочный TiLV положительные образцы или соответствующий фрагмент TiLV cDNA клонирования в к плазмиды. Подготовка мастер смесь ПЦР согласно указаниям системы ДНК-полимеразы и количество образцов и элементов управления для проверки. Согласно руководящим принципам выбранного ДНК-полимераза объединить назначенный объем Мастер микс с предлагаемое количество cDNA проб и управления. Примечание: Подготовка 0. Выполняйте ПЦР Велоспорт условий согласно руководящим принципам использования ДНК-полимеразы системы и с использованием соответствующей температуры отжига для грунтовки в эксплуатации Таблица 1. Отдельные амплифицированного ДНК электрофорезом геля и пятно гель, бромид ethidium EthBr для облегчения визуализации полос ДНК ожидаемого размера Таблица 1 в машине гель документации с помощью ультрафиолета. Предупреждение: Бромистый этидий токсичен; Это должны быть обработаны с осторожностью ношение надлежащей защитную одежду и защитные перчатки. Подготовка мастер смесь ПЦР для всех образцов, стандартов и контроля, принимая во внимание, что реакция должна быть выполнена в двойные или тройные используя 0. Главный микс SYBR зеленый защищайте от света. Мкл 4 шаблон cDNA, элементы управления или серийно разбавленных TiLV стандартов в трубы или скважин 96 хорошо пластины. Закройте ПЦР трубы или печать 96 также пластины с совместимым покрытие для ПЦР машины используется Осторожно проведите ПЦР трубы смешать раствор и спин вниз трубы ПЦР или 96 хорошо пластины, собрать все жидкости в нижней части судов с помощью центрифуги. Место труб или пластины в реальном времени тепловая велосипедист. Машина начнет работать после того, как крышка достиг нужной температуры. Соберите флуоресценции каждого образца после каждого шага расширение для контроля за ходом реакции. Примечание: ПЦР машины и программное обеспечение будет автоматически вычислить все параметры анализа и отображения амплификации кривых в режиме реального времени, в то время как стандартный и плавления кривой будет создаваться в конце цикла ПЦР. Выполнить анализ данных и приобретения обеспечивая первый, что таяние кривые для каждого образца и стандарта имеют один единый пик на ожидаемой температуре для amplicon. Оценивать усиления кривых образцов и стандартов и установить порог в регионе были уровень усиления cDNAs одинакова во всех пробах. Это обычно выполняется автоматически программное обеспечение, но должны быть тщательно проверены. Рассчитайте количество копий TiLV, с использованием стандартной кривой. Play Video. Cite this Article Nicholson, P. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2. An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.

Купить Спайс россыпь в Голицыне

Бангкок купить LSD 220 mkg

Закладки кокаина Сиде