Балей купить закладку LSD 220 мг

🔥Мы профессиональная команда, которая на рынке работает уже более 5 лет и специализируемся исключительно на лучших продуктах.

У нас лучший товар, который вы когда-либо пробовали!

______________

✅ ️Наши контакты (Telegram):✅ ️

>>>НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ (ЖМИ СЮДА)<<<

✅ ️ ▲ ✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ️✅ ▲ ✅ ️

_______________

ВНИМАНИЕ! ВАЖНО!🔥🔥🔥

В Телеграм переходить только по ССЫЛКЕ что ВЫШЕ, в поиске НАС НЕТ там только фейки !!!

_______________

Балей купить закладку LSD-25 (HQ) 250мкг

Балей купить закладку LSD 220 мг

Спасск-Дальний купить Ecstasy Rolls Royce

SILAC иммунопреципитации эксперименты представляют собой мощное средство для обнаружения новый белок: белковых взаимодействий. Допуская точное относительное количественное определение белка изобилии в контрольной группе и тестовых образцов, истинных взаимодействий может быть легко отличить от экспериментальных загрязняющих веществ и низкой аффинности взаимодействия сохраняется за счет использования менее жестких условиях буфера. Количественные протеомика в сочетании с очистки иммуно-аффинной, SILAC иммунопреципитацией, представляют собой мощное средство для открытия нового белка: белковых взаимодействий. Допуская точную количественную оценку относительного белка изобилии в контрольной группе и образцов, истинные взаимодействия могут быть легко отличить от экспериментальных загрязнений. Низким сродством взаимодействия могут быть сохранены путем использования менее жестких условиях буферных и быть легко идентифицировать. Этот протокол обсуждает маркировки клетках тканевой культуры с стабильный изотоп меченых аминокислот, трансфекции и иммунопреципитации сродством отмеченных интерес белок, после чего готовится для представления к массовому объекта спектрометрии. Этот протокол, то обсуждается, как анализировать и интерпретировать данные, возвращенные из масс-спектрометра с целью выявления клеточных партнеров, взаимодействующих с белком интересов. Существенным шагом в понимании функции белка является выявление соответствующих взаимодействующих белков. Где такие белки неизвестны есть ряд методов доступны, каждый со своими достоинствами и недостатками. К ним относятся дрожжи двух гибридную систему, раскрывающиеся анализов с использованием рекомбинантного белка, а также очистку тандем сродства или TAP-тегов 1, 2. Более недавнее дополнение к этих методов является сочетание аффинной очистки интересующего белка от соответствующей линии клеток млекопитающих, а затем количественного масс-спектрометрии с использованием изотопа стабильного маркировки аминокислот в клеточной культуре SILAC 3. Кроме того, как образец анализировали обычно целом, а не в виде отдельных белковых полос, белки, представляющие интерес, не маскируется аналогично миграции белки в геле, и они, как правило, должны присутствовать в достаточном уровне, чтобы быть видимыми после окрашивания, что приводит к увеличение числа уверенно идентифицированных белков 4. Чтобы избежать необходимости создания стабильных клеточных линий временная трансфекция был использован для доставки этих конструкций в стабильный изотоп меченых клеток Т. SILAC иммунопреципитацию позволяет выявить не только прямых взаимодействий, но и низким сродством или косвенных взаимодействий с белковыми комплексами 4. Примечание: использование трипсина-EDTA следует избегать на всех этапах пассажей и подготовки экспериментальных образцов для анализа, как трипсин может содержать немеченые аминокислоты, которые привели бы к неполной маркировки образцов. Понимание результаты, и отмена низкого доверия идентификаций. Примечание: Перечень заголовков столбцов, возвращаемых программного обеспечения Протеом Discoverer приведены в таблице 1 DIF. Выбор высокого доверия Взаимодействие для дальнейшего изучения. Примечание: Чтобы быть уверенным в выявлении партнеров взаимодействия типичный SILAC пулдаун эксперимент в идеале должны быть выполнены три раза, с средних и тяжелых меченых образцов включается для одного из повторов по контролю для любого эффекта СМИ о результатах. В то время как загрязняющие вещества теоретически должна группироваться вокруг SILAC логарифма отношения 2 0, это не обязательно так, пример этого приведен на рис 3. Возможными причинами этого включают несовершенную SILAC маркировки клеток, загрузка неравные объемы или концентраций лизата на анти-GFP бусы, случайной потери из бисера во время очистки или неравной смесиING образцов в конце процедуры очистки 3. Тем не менее, предполагая данные анализируются на основе порогового стандартного отклонения от среднего значения нормально распределенных примесей, незначительные сдвиги в центрирования данных не должны влиять на качество результатов. При сравнении различия в белковых взаимодействий между двумя родственных белков, аналогичная ситуация может возникнуть, когда один интерес белок производится до более высоких уровней, чем в клетках второго или из-за различий в эффективности трансфекции, или внутреннее свойство белка или мРНК. Некоторые изменение в выражении например, 2А может быть скорректирована на основе анализа соотношение SILAC для этих двух образцов. Таблица 1. Стандартные заголовки столбцов из отчета Протеом Discoverer. В то время как полезная информация может быть получена от всех этих столбцов, те критическим для этого анализа, выделены жирным шрифтом. Таблица 2. Рисунок 1. Экспериментальный план. Во-первых клетки выращивают в средах без аргинин и лизин и замещенный стабильного изотопа меченого аргинин и лизин в течение 2 недель 1. Затем данные анализируются, чтобы удалить низкий идент уверенность белкаifications и выбрать уровень обогащения белка, соответствующего подлинных взаимодействующих белков. Рисунок 2. Подтверждение подходящие условия иммунопреципитации. A Вестерн-блот анализ клеточных лизатов, а также несвязанные и связанные фракции из иммунопреципитации подтверждает экспрессию и иммунопреципитации белка, представляющего интерес. Вестерн-блот против GAPDH подтверждает истощение невзаимодействующих белков и еще вестерн-блоттинга известная взаимодействующих партнером eIF4A подтверждает успешное иммунопреципитацию белков, связывающихся с белка. B Где взаимодействующие партнеры интерес белка не известны, окрашивали серебром гель может подтвердить иммунопреципитацию взаимодействующих белков. Рисунок 3. Представитель результаты. Белки в зеленый были представляющий интерес белок, используемый для выпадающего меню белков, взаимодействующих с заштрихованы от красного до белого в зависимости от войти 2 соотношение SILAC в SILAC IP с красным является наиболее распространенный белок в анализе, и белый быть отсечка 1. Белки, окрашенные в серый не были определены в этом анализе. Стратегия пулдаун SILAC описано здесь представляет собой очень чувствительные и мощные средства обнаружения новый белок: белковых взаимодействий, и, кроме того позволяет быстро и просто дискриминация измененных обязательных моделей между тесно связанных образцов, представляющих интерес. Насколько известно автору, это первое исследование, в литературе эксплуататорского полезность SILAC протеомики исследовать клеточный интерактома этих двух изоформ eIF4A. Подход, как описано выше использует GFP-тегов и анти-GFP бусы 9, 10 и, следовательно, изменения могут потребоваться, с тем чтобы этот подход, который будет использоваться для конкретного интересующего белка, например, является ли тег помещается в N-или С-конец белка. Где это возможно, западные пятна или функциональные тесты должныбыть выполнены, чтобы обнаружить связывание известного партнера белка взаимодействия. Такие эксперименты были описаны в другом месте в литературе, но вкратце, шаг 1 и шаги 5. Как этапы количественного позволяют неспецифического связывания белков должны быть удалены на уровне анализа, рекомендуется опустить преинкубации с контрольными бисером, или высоких моет соли для того, чтобы сохранить низким сродством белок: белковые взаимодействия с интересующего белка. Нуклеазы мау быть включены или исключены из этого протокола в соответствии со спецификой конкретного эксперимента. Например: как белки, используемые в этом методе являются РНК геликазы, РНКазы коктейль был включен в протокол, чтобы удалить косвенного взаимодействия, опосредованные через РНК шаг 3. Однако в некоторых случаях, не может быть выгоду от запуска параллельных экспериментов с и без нуклеазы определить нуклеиновых кислот зависимые взаимодействия. В рамках этого протокола, переключение 'среды' и 'тяжелых' образцов в повторных экспериментах рекомендуется контролировать для изменения введенной различий в SILAC СМИ или рост клеток. Альтернативный контроль включает в себя последовательное переключение всех трех «легкие», «среднего» и «тяжелый» СМИ в реплик экспериментов. В то время как этот подход является потенциально более строгими, это увеличить сложность анализа, как минимум в одной репликации, представляющего интерес белка шплохо быть произведены в «свет» меченых клеток и поэтому необходимо различать белков последовательно, определенных в «свет» образцов загрязнители окружающей среды, такие как кератинами , и те, которые обогащены только в «свет» образцов при связывании с белком интерес. В то время как использование количественного данных позволяет различение конкретных-от неспецифических взаимодействий за счет использования порогового значения, неизбежно некоторые подлинные взаимодействия могут быть отброшены. Подход выше простой и быстрый подход к идентификации белков: белковых взаимодействий, которые могут быть легко попытки исследователей без предыдущего опыта с масс-спектрометрии, или анализа большого белка: наборы данных белковых взаимодействий. Для большинства применений этого более чем достаточно для идентификации новых белков, представляющих интерес. Дальнейшие модификации данного подхода, чтобы помочь уменьшить эту потерю данных описаны в другом месте в литературе и включают использование пр. Тем не менее, в зависимости от конкретных экспериментальных параметров может быть необходимо, чтобы запустить ряд контрольных экспериментов, чтобы генерировать шарик протеом и, следовательно, это может увеличить как расходы и сложность эксперимента. Дополнительная информация об этой технике можно получить в www. Следует также отметить, что протокол, описанный выше включает смешивание по-разному меченых проб в конце процесса иммунопреципитации называется смесительной после очистки - MAP SILAC эксперимента. Это делается белка: белковые взаимодействия происходить при заданной равновесия Следует отметить, что другие группы объединили Эта карта SILAC подход, описанный в данном протоколе с инкубации образцовдо пулдауна очистка после смешивания - PAM SILAC для различных отрезков времени 20 мин до 2 ч, были использованы в литературе 15, На основе того, насколько быстро падает соотношение белок к , то можно качественно исследовать аффинности связывания и для определения белков в качестве стабильных или динамических взаимодействующих белков Таким образом, SILAC Pulldowns представляют собой очень мощные средства идентификации белков, взаимодействующих с данной интерес белка, в физиологически соответствующего обстановке. Этот метод может быть очень легко адаптировать к ряду различных стратегий очистки, что позволяет его применение к той или иной интерес белка. Количественное определение результатов значительно упрощает идентификацию подлинных взаимодействий и позволяет релаксацию жестких условиях буфер, используемый для удаления неспецифических связующих и, следовательно, сохраняет низкие взаимодействия сродством. Как до трех образцов можно сравнить в приведенном вышеСтратегия, техника имеет четкие преимущества в сравнении различия в Связывание белков между различными белковых изоформ, мутантных белков, или эффекта фармакологических ингибиторов. Emmott, E. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Biology. Генерация и пассажи SILAC меченных клеточных линий Примечание: использование трипсина-EDTA следует избегать на всех этапах пассажей и подготовки экспериментальных образцов для анализа, как трипсин может содержать немеченые аминокислоты, которые привели бы к неполной маркировки образцов. Клетки должны быть сохранены в среде в течение минимум 5 делений, чтобы обеспечить полноемаркировка. Чтобы разделить клетки для пассажей, клетки должны быть вытеснены из монослоя, нажав колбу. Альтернативы включают использование сотовых скребками или с помощью фермента свободной, PBS-буфера на основе клеточной диссоциации. Примечание: Для экономии средств массовой информации, камеры должны быть пассировать в колбы Т25 и большее число клеток генерируется только непосредственно перед экспериментом. За 24 часа до трансфекции клеток, семян 3,5 х 10 6 SILAC меченных клеток в единый 10 см 2 блюдо для каждой экспериментальной состоянии ведется расследование. Примечание: Антибиотики не должны быть добавлены в средствах массовой информации, так как они могут мешать эффективности липосом на основе реагентов трансфекции. Смешайте реакцию тщательно с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 мин и затем добавляют по каплям к клеточный монослой. Рок планшет слегка из стороны в сторону. Сбор клеточных лизатов Урожай клеток в чашке в охлажденный льдом PBS с использованием клеточного скребка. Сбор клеток путем центрифугирования при х г, ; C в течение 5 мин. Промыть клетки еще 3 раза в 10 мл охлажденного льдом PBS. Примечание: белков с известной нуклеиновой кислоты связывающую активность, это может быть необходимо добавить нуклеазы в лизате до осаждения. В случаях, когда нуклеазы добавлен, образцы должны быть инкубировали на льду в течение 30 мин на льду, с пипеткой каждые 10 мин. Извлечение общей нуклеиновой кислоты из небольшой части образца и анализ методом электрофореза в агарозном геле можно проверить эффективность нуклеазы. Концентрация клеточного лизата должны быть оценены ВСА в соответствии с инструкциями изготовителя. С помощью лизирующего буфера, содержащий коктейль ингибиторов протеаз III нормализовать концентрацию белка в конечном объеме мкл. Примечание: Обычно выходы варьироваться в зависимости от ,5 мг белка в конечном 1 мл образца. В то время как указанные выше буферы пригодны для многих белков, представляющих интерес, для других это может быть необходимо модифицировать буферные компоненты, чтобы обеспечить белок солюбилизируют приманки и поддерживать белок-белковых взаимодействий. Возможные изменения включают в себя буферный агент фосфат, HEPES , концентрацию соли мм , то выбор моющего средства, или другие добавки. Использование пипетки мкл с конца отрезаны, передать 25 мкл шариков на образца в свежую пробирку. Примечание: Пользователь должен подготовить бисером для одного SILAC эксперимента как Mastermix минимизации образца к образцу изменение. Для каждого 25 мкл суспензии борта, добавьте 20 томов мкл на 75 мкл суспензии буфера для разведения, и центрифуга шарики в мкг в течение 5 мин. Далее, Вымойте бисером еще 2 раза в 20 объемах буфера для разведения. Добавить мкл буфера для разведения за 25 мкл шарик суспензии. Использование наконечника мкл с конца отрезаны, трансфер 85 мкл этой ресуспендированного суспензии в каждый из SILAC меченных образцов, полученных на шаге 3. Стиральная, Элюция, и подготовка образцов для MS анализа Центрифуга образцов при мкг в, 46; С в течение 5 мин. Супернатант должны быть отброшены. Это должно быть выполнено дважды. Для представления в масс-спектрометрии объекта, смешать меченых образцов например, 10 мкл каждый и представить смешанный образец. Пример приведен на рис Юр 2 показывает специфическое связывание известного партнера взаимодействия - eIF4G по вестерн-блоттинга, и появление серебряных окрашивания полос, присутствующих в выпадающих образцов из интересующего белка, но не контрольного образца. Это обычная представить 30 мкл общей сложности образца IP для анализа. Это повлечет за собой смешивание 10 мкл меченных света образца с 10 мкл меченных средних и тяжелых 10 мкл меченных проб, чтобы дать общей 30 мкл. Понимание результаты, и отмена низкого доверия идентификаций Примечание: Перечень заголовков столбцов, возвращаемых программного обеспечения Протеом Discoverer приведены в таблице 1 DIF. Прежде, чем идти через данные, сначала скопируйте исходные данные, чтобы новую электронную таблицу. Из этой таблицы удалить все столбцы, кроме тех, давая инвентарный номер, число уникальных пептидов, коэффициенты сравнении образцов, вариабельность отношение, описание белка. Если были выполнены реплики эксперименты, они должны быть объединены в один файл Excel, причем каждый эксперимент появляться на отдельной вкладке. Примечание: низкий данные уверенность включает в себя белки, определенные только одной уникальной пептида, и те, шздесь количественная не удалось. Затем сортировать по соотношению и удаления белков, которые не имеют отношения SILAC бескванторная белки. Примечание: как отношение SILAC результатов в любых данных для белков, показывающих уменьшение обилия ограничивается до значений от 0 до 1, это обычная для преобразования соотношение SILAC в соотношении журнал 2 SILAC, так как это означает, белки и увеличивается или уменьшается в образец представлены в логарифмической шкале, где 2 или -2 представляет собой 4-кратное увеличение или уменьшение в изобилии, и 3 или -3 9-кратное увеличение или уменьшение в изобилии соответственно. Примером этого дается на рисунке 3. Нажмите меню в выпадающем окне 'Insert' и выберите 'Новый анализ'. Хранение параметры по умолчанию нажмите «OK». Примечание: Этот шаг генерирует гистограмму, иллюстрирующую количество белков, определенных в заданном соотношении. Это должно сформировать распределение Гаусса. Выберите раздел распределения частот. Примечание: Этот шаг соответствует кривой с данными распределения частот, генерируемых на этапе 7,3, получая значения, которые впоследствии могут быть использованы для вычисления пороговые значения для значения. В окне результатов, которое появляется, среднее значение и стандартное отклонение даны. Создайте порог, добавив 1,96 стандартных отклонений к среднему. Примечание: Эти значения представляют собой среднее и стандартное отклонение Гаусса р-нribution, а не общее набор данных. Порог должен быть определен индивидуально для каждого эксперимента реплики, как это может варьироваться. Объединение Реплика наборов данных Примечание: Чтобы быть уверенным в выявлении партнеров взаимодействия типичный SILAC пулдаун эксперимент в идеале должны быть выполнены три раза, с средних и тяжелых меченых образцов включается для одного из повторов по контролю для любого эффекта СМИ о результатах. Вернуться на файл Excel, создать новую вкладку под названием «Объединенный». Столбце Метка 'Присоединение' и скопировать все номера вступлении друг от ое отдельные эксперименты в этой одной колонке. Выберите вкладку «Данные», а затем опцию 'удалить дубликаты. На вкладке описание, использовать формулу ВПР собрать описание каждого инвентарным номером. Перетащите формулу вниз по колонне, чтобы заполнить в описании белка. ColumnsAccross является число столбцов напротив вступления питBER в колонке А требуемое значение лежит. Примечание: Например, если число Присоединение находится в колонке А, и данные интерес лежит в колонке Е. Значение здесь будет 5 колонка приравнивается к 1. Как регистрационные номера были объединены на стадии б, то, скорее всего, что ВПР не получит все необходимые имена из одного эксперимента. Выберите стиль 'Classic'. В поле типа в значения стандартного отклонения 1,96, и нажмите «OK». Оценка изменчивости соотношения для каждого позитивного взаимодействия. Примечание: Это представляет, насколько последовательны отдельные коэффициенты для каждого пептида, которые вместе составляют соотношение SILAC белков »являются, и выражается в процентах. Когда изменчивость соотношение учитывается и белок дает отношение SILAC выше порога, этот белок представляет хит. Если изменчивость соотношение дает диапазон, который падает ниже порога, 'хит' может представлять собой загрязнитель. Повторите эту процедуру для каждого из столбцов результатов и сравнить через экспериментов. Выделенные белки, определенные в двух или более экспериментов представляют собой высокий доверительный уровень взаимодействия. Примечание: В зависимости от используемой базы данных, чтобы назначить белковые цифры о вступлении, в различных экспериментах белок, возможно, были определены под другим, или даже нескольких номерами доступа. Важно, чтобы проверить это, чтобы гарантировать, что белки не случайно опущено. При более низком коэффициенте наблюдались для членов комплекса eIF3. Тем не менее, это ясно показывает, что эксперимент удовлетворительно определены прямые и косвенные обязательные партнеров eIF4AI и II. Как и следовало ожидать от своей идентичности высокой последовательности 6, белок: белковые взаимодействия появился во многом сохраняется между двумя изоформ в этой экспериментальной системе 7, 8. Выбор некоторых из взаимодействующих белков приведены в таблице 2, иллюстрирующий формат данных. Исключает изменения известково. Теоретическое изоэлектрическая точка белка Счет Общий балл белка который представляет собой сумму Individual забивает пептидные. Точная оценка требуется для значения будут варьироваться между экспериментами. Play Video. Cite this Article Emmott, E. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Please enter your institutional email to check if you have access to this content. Please create an account to get access. Forgot Password? To receive a free trial, please fill out the form below. Not your institution? A JoVE representative will be in touch with you shortly. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Thank You. Please enjoy a free hour trial. In order to begin, please login or create an account. Please click here to activate your free hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. Общий балл белка который представляет собой сумму Individual забивает пептидные. Относительная интенсивность пептидов в именованный меченого образца, по сравнению со вторым меченым образца. Количество коэффициентов пептидных, которые были использованы для расчета данного коэффициента белка. Изменчивость отдельных коэффициентов пептидных, используемых для расчета данного коэффициента белка. Resuspend 0. The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.