Бактериальные лизаты.

Введение.

Бактериальные лизаты, или препараты лизатов, приобрели значительный интерес в качестве потенциальных средств профилактики различных респираторных инфекций. В этой статье мы обсудим различные методы получения лизатов, механизм их действия и эффективность этих препаратов в профилактике инфекций верхних и нижних дыхательных путей, острого среднего отита.

Методы получения лизатов.

Производители бактериальных лизатов утверждают, что они оказывают локальное и системное иммуномодулирующее действие, но проводимые клинические испытания показывают различные результаты. Отсутствие последовательности прогнозируемых терапевтических эффектов снижает клиническое использование лизатов и даже и препятствует их лицензированию в нескольких странах. Одно из объяснений отсутствия равнозначных результатов заключается в том, что методы их создания различаются и в исследованиях могут оцениваться различные по способу получения результаты.

Как правило, бактериальные лизаты получают с помощью процесса, который включает лизис (лизис - это разрушение клеток) бактерий с последующей очисткой. Для приготовления лизата могут использоваться различные типы бактерий, включая как лизаты из одного штамма, так и препараты из нескольких штаммов. 

Существует несколько методов создания бактериальных лизатов, каждый со своими преимуществами и областями применения.

1. Механическое разрушение. Этот метод включает физическое разрушение бактериальных клеток для высвобождения их содержимого. Механическое разрушение эффективно для получения лизатов, содержащих различные клеточные компоненты, включая белки, нуклеиновые кислоты и компоненты клеточной стенки.

2. Химический лизис. Химический лизис включает обработку бактериальных клеток химическими агентами для разрушения их мембран и высвобождения клеточного содержимого. Химический лизис часто используется, когда требуется бережное извлечение определенных клеточных компонентов.

3. Ферментативное расщепление. Ферментативное расщепление включает обработку бактериальных клеток ферментами для разрушения клеточных стенок и высвобождения внутриклеточного содержимого. Ферментативное расщепление полезно для получения лизатов, обогащенных специфическими клеточными компонентами.

4. Циклы замораживания-оттаивания. Циклы замораживания-оттаивания включают замораживание бактериальных клеток с последующим оттаиванием для разрушения клеточных мембран и высвобождения клеточного содержимого. Этот метод прост и эффективен для получения сырых бактериальных лизатов, но может не подходить для извлечения определенных клеточных компонентов.

5. Щелочной лизис. Щелочной лизис включает обработку бактериальных клеток щелочными растворами для разрушения клеточных мембран и высвобождения плазмидной ДНК. Этот метод обычно используется в молекулярной биологии для извлечения плазмидной ДНК, но также может быть адаптирован для получения бактериальных лизатов.

6. Лизис бактериофагами. Лизис бактериофагами включает заражение бактериофагами (вирусами, которые заражают бактерии) бактериальных клеток, что приводит к лизису клеток и высвобождению фаговых частиц вместе с клеточным содержимым. Этот метод часто используется для крупномасштабного производства бактериофагов, а также может быть использован для получения бактериальных лизатов, обогащенных специфическими фаговыми белками.

Два наиболее распространенных метода, используемых для лизиса бактерий, - это щелочная обработка и механическое разрушение. Механические лизаты содержат частицы, которые сохраняют несколько особенностей неповрежденных антигенных молекул, тем самым обеспечивая лучшее взаимодействие с Toll-подобными рецепторами, что является одной из первоначальных целей этих препаратов. Тем не менее, метод имеет ограничение по объему вырабатываемого тепла, которое должно быть сведено к минимуму, чтобы избежать денатурализации белка в процессе, и он дороже, чем щелочной лизис. Каждый штамм бактерий выращивается независимо, собирается и инактивируется выбранной процедурой, а затем, по желанию, отдельные лизаты смешиваются в фиксированных пропорциях, чтобы создать поливалентный лизат.

Среди коммерчески доступных составов, подготовленных с помощью щелочного лизиса, есть OM-85 BV (Broncho-Vaxom), который представляет собой смесь H. influenzae, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Klebsiella ozaenae, S. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans и M. catarrhalis. Минусом данного лизата является то, что компания не предоставляет доступ к подробному протоколу подготовки, предусматривающему, например, концентрацию NaOH, температуру или периоды, используемые для процесса лизиса клеток.

Крупнейшим продаваемым механически созданным лизатом является Ismigen, который также является поливалентным механическим бактериальным лизатом, состоящим из: S. aureus, S. pyogenes, S. viridans, K. ozaenae, H. influenzae type b, M. catarrhalis и S. pneumoniae.

Механизм действия.

Повышенная эффективность устранения бактериальных патогенов при рецидивирующих инфекциях воспалительных путей объясняется иммунологической паматью. Механизм действия иммуностимулирующих продуктов заключается во взаимодействии с слизистой оболочкой лимфоидных тканей (MALT). Основная роль системы MALT заключается в производстве антител IgA, которые в своей секреторной форме (sIgA) выполняют защитную функцию, оказывая бактериостатическое действие, предотвращая адгезию эндотелия и нейтрализуя токсины. Специфический сублингвальный маршрут введения способствует эффективной доставке лизатов в дендритные клетки, которые в изобилии присутствуют в слизистой оболочке полости рта. После распознавания антигенов и экспрессии специфических биомаркеров на поверхности дендритных клеток клетки активируются и переносятся в шейные лимфатические узлы, а затем в кровоток. В шейных лимфатических узлах активированные дендритные клетки, также называемые антиген-презентирующие клетками, специально выделяют провоспалительные цитокины, которые облегчают дифференцировку Т-клеток в Т-хиллерные клетки, дифференцировку В-клеток в плазмоциты, способные выделять специфические IgA, IgG и IgM и увеличивать количество лимфоцитов, которые называются естественными киллерами. Зрелые иммунные клетки и иммуноглобулины транспортируются из лимфатических узлов в кровь. Специфические IgA и зрелые иммунные клетки затем транспортируются в слизистую оболочку верхних и нижних дыхательных путей, в результате чего увеличивается секреция слюнных иммуноглобулинов.

Бактериальные лизаты содержат молекулярные структуры, известные как ассоциированные с патогеном молекулярные структуры, такие как липополисахариды, липопротеины, пептидогликаны и бактериальная ДНК. Они могут взаимодействовать с рецепторами распознавания образов, экспрессируемыми на поверхности иммунных клеток, такими как toll-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы и рецепторы лектина C-типа. Их активация активирует неспецифические защитные механизмы, увеличивая выработку макрофагов, дендритных, тучных клеток, которые улучшают местную иммунную готовность слизистых мембран и повышают цитотоксичную активность фагоцитов.

Гипотетический механизм противовирусной активности.

Иммунный эффект бактериальных лизатов достигается за счет активации неспецифических, а также специфических иммунных механизмов. Вирусная инфекция облегчает бактериальную колонизацию, изменяя локальные защитные механизмы в дыхательных путях и способствуя изменениям в клеточных мембранах, что приводит к более легкой адгезии бактериальных клеток. С другой стороны, бактерии облегчают вирусные инфекции путем протеолитической деградации гемагглютинина. Исследования показывают, что механические лизаты могут оказывать благотворное влияние на «порочный круг» бактериальных и вирусных взаимодействий. Другое исследование продемонстрировало стимулированное созревание циркулирующих и плазмацитоидных дендритных клеток, участвующих в врожденном иммунном ответе и обнаружении вирусов после введения механического лизата. Также стоит напомнить про стимуляцию естественных киллеров, участвующих в элиминации инфицированных вирусом клеток.

Профилактика инфекций респираторного тракта.

В 2020 году вышло консенсусное заявление экспертов Всемирной ассоциации инфекционных заболеваний и иммунологических расстройств, а в 2022 году обзор о том, могут ли лизаты быть полезны в профилактике вирусных инфекций респираторного тракта у детей.

В консенсусе от 2020 года рассмотрен только один бактериальный лизат, полученный методом щелочного лизиса. Для оценки его эффективности в консенсусе рассмотрены мета-анализы от 2003, 2010, 2016 годов, несколько РБК.

В мета-анализе 2016 года было отобрано 53 исследования. В общей сложности 2491 ребенок получил лизат и 2360 - плацебо. Значительное снижение частоты новых инфекций респираторного тракта было подтверждено в группе детей, получивших лизат, по сравнению с контрольными. Кроме того, было отмечено более короткое время, которое было затрачено на лечение антибиотиками по сравнению с контролем. Однако, когда были проанализированы характеристики исследований, было доказано, что большинство из них имели значительные методологические проблемы. Кроме того, размер исследований, как правило, был небольшим, при этом только два исследования, опубликованных на английском языке, были с не менее чем 100 детьми в каждой группе вмешательства. Расчеты мощности, как правило, не проводились, что делало выводы весьма спорными. Наконец, методология не была четко описана в большинстве исследований. Только в 14 исследованиях был правильный метод рандомизации и правильный метод распределения, соответственно, и только 12 были дважды слепы. 

Однако лучшие выводы можно сделать из мета-анализа исследований от 2010 года, где проанализированы исследования, опубликованные до 2007 года. Было отобрано восемь исследований с детьми, страдающими рецидивирующими инфекциями респираторного тракта. Когда эти исследования были объединены, было подсчитано, что дети, которые получали лизат 10 дней каждый месяц в течение 3 месяцев подряд, переносили меньшее количество рецидивов инфекции в течение 6 месяцев, чем у контрольных групп, получавших плацебо. Кроме того, было доказано, что эффект лизата был более значительным для детей младшего возраста. 

Другой мета-анализ, от 2003 года, показал снижение среднего уровня острых инфекций респираторного тракта на 36% у детей с рецидивирующими инфекциями, получавших данный лизат. 

Этот вывод, похоже, еще больше подтверждается результатами недавнего рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования. В него было включено 288 детей в возрасте от 1 до 6 лет с рецидивирующими инфекциями респираторного тракта, которые были распределены на три группы: для получения лизата в течение 3 месяцев, плацебо в течение 3 месяцев или лизата в течение 6 месяцев. Появление инфекций контролировалось в течение 6 месяцев, начиная с первого введения лизата или плацебо. Количество детей, которые страдали от по крайней мере одного эпизода инфекции, было значительно ниже в группе, получающей лизат в течение 3 месяцев, чем в группе, получившей плацебо. Интересно, что в этой исследуемой популяции не наблюдалось никакой разницы в заболеваемости инфекцией респираторного тракта между детьми, которым давали лизат в течение 3 месяцев и 6 месяцев, что говорит о том, что защита, вызванная 3-месячным профилактическим лечением, сохраняется в течение нескольких месяцев после окончания лечения.

Согласно консенсусу и указанных в нем исследованиям бактериальный лизат, полученный методом щелочного лизиса, действительно эффективен в профилактике рецидивирующих инфекциями дыхательных путей, но без уточнения локализации инфекции в верхних или нижних дыхательных путях, а также без указания причины инфекции - вируса или бактерии. Косвенные признаки того, что речь все же про бактериальные инфекции нижних дыхательных путей, кроются в мета-анализе от 2016 года и в нескольких исследованиях. Если обобщить сказанное в них, то рецидивирующие инфекции респираторного тракта считаются при больше чем 3 эпизодах в год, что явно мало для вирусных инфекций. А выводы о профилактике обострений бронхиальной астмы и ХОБЛ скорее указывают на воспаление нижних дыхательных путей, а не верхних.

В обзоре от 2022 года, который посвящен уже только возможной профилактике вирусных инфекций дыхательных путей у детей, также исследовался только один лизат, приготовленный путем щелочного лизиса. Исследование проводили с использованием эпителиальных клеток бронхов человека in vitro, т.е. в пробирке, а также на мышах, с оценкой эффективности визита против риновируса человека, вируса гриппа, респираторного синцитиального вируса и SARS-CoV-2. Согласно результатам обзора, лизат действительно может способствовать эффективной противовирусной активности, модулируя структуру и функции большого количества эпителиальных и иммунных клеток дыхательных путей, даже при интраназальном введении, что доказано в нескольких экспериментах на мышах. Есть некоторые предварительные доказательства того, что лизат также может стабилизировать микробиоту для содействия сбалансированному иммунному состоянию и здоровью дыхательных путей, но необходимо больше данных. Результаты этих исследований, которые показывают, что лизат может повысить противовирусную активность, свидетельствуют о том, что введение лизата может быть важно в клинической практике, но пока это гипотеза, которая должна быть подтверждена будущими исследованиями и клиническими испытаниями.

Вывод.

Эта статья содержит обобщенную информацию касательно производства, механизма действия и эффективности бактериальных лизатов.

Несмотря на их значимость и актуальность для системы здравоохранения, а также несмотря на количество исследований, проведенных на клиническом уровне, существует необходимость в более стандартизированных протоколах для их приготовления, потому что в литературе либо подробно не описываются процедуры лизиса, либо эти данные не доступны для исследовательского сообщества. Если в лаборатории отсутствуют стандартизированные протоколы, это может привести к различиям в производстве лизатов. В свою очередь это может привести к ошибочным оценкам, которые могут быть сделаны по поводу эффектов, которые они создают, что иногда приводит к диаметрально противоположным выводам. И из-за этого страдает качество исследований, что в свою очередь не дает в настоящее время однозначного ответа - есть ли смысл использовать бактериальные лизаты в профилактике инфекций дыхательных путей. Однозначно можно сказать только то, что снижение экологических факторов, способствующих рецидивирующим инфекциям, вакцинация и систематическое применение традиционных методов профилактики инфекций, таких как мытье рук, остаются лучшими мерами для предотвращения рецидивирующих инфекций у детей.