Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии - Биология и естествознание дипломная работа

Главная

Биология и естествознание
Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

Механизм образования активных форм регуляторных пептидов. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента. Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.


посмотреть текст работы


скачать работу можно здесь


полная информация о работе


весь список подобных работ


Нужна помощь с учёбой? Наши эксперты готовы помочь!
Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с
политикой обработки персональных данных

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Пензенский государственный педагогический университет
Факультет Естественно-географический
Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
_____________________ Лобзина Е. С.
______________________ Сметанин В. А.
____________________________ Генгин М.Т.
1.1. Противоопухолевая химиотерапия
1.1.1. Механизм действия противоопухолевых препаратов
1.2.1. Механизм образования активных форм регуляторных пептидов
1.2.2. Роль биологически активных пептидов
1.2.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов
1.2.3.1. Ангиотензинпревращающий фермент
1.3. Функционирование пептидергической системы при онкологических заболеваниях
1.4. Роль оксида азота (II) в онкогенезе
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы N
2.2.2. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента
2.2.3. Метод определения содержания белка
2.2.4. Метод количественного определения оксида азота (II) в сыворотке крови
2.3. Статистическая обработка результатов исследования
3.1. Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
3.2. Исследование ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
3.3. Исследование содержания нитрит-иона в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
1.2 .1 М еханизм образования активных форм регуляторных пептидов
Активные формы пептидов представляют собой полифункциональную группу веществ, которым отводится важная роль природных биорегуляторов. Это природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков ?-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O)-NH. Большинство регуляторных пептидов образуется из физиологически неактивных белков-предшественников, путем посттрансляционного процессинга [32]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР. Благодаря наличию на N-конце сигнальной последовательности, состоящей из остатков гидрофобных аминокислот, обеспечивается транслокация пептида через мембраны ЭПР. В полости ЭПР отщепление этой последовательности осуществляется при участии сигнальной пептидазы. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [14,61].
Сначала под действием эндопептидаз образуются неактивные пептиды, содержащие со стороны С- или N-конца “лишние” остатки аминокислот, которые затем удаляются экзопептидазами с карбоксипептидазо-B- и аминопептидазо-B-подобной активностью [4].
Уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена, к которым в частности принадлежат АПФ и КПN [13,27,32].
В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности данных ферментов у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии, которое прямо или косвенно влияет на какую-либо систему организма.
1.2 .2 Роль биологически активных пептидов
Область биологической активности пептидов чрезвычайно широка. Они влияют на состояние сердечно-сосудистой, иммунной, половой, эндокринной, пищеварительной и других систем, изменяют энергетический обмен в организме, участвуют в регуляции работы центральной нервной системы. КПN и АПФ играют важную роль в обмене ангиотензина и брадикинина [31,54].
Ангиотензины - пептиды, образующиеся в организме из белка плазмы ангиотензиногена. Почечный фермент ренин отщепляет от молекулы ангиотензиногена неактивный декапептид ангиотензин I. Другой фермент крови - АПФ - преимущественно в ткани легких отщепляет с карбоксильного конца молекулы ангиотензина I дипептид с образованием ангиотензина II. Ангиотезин II является физиологическим фактором роста клеток, обладает митогенными (учащающими деление) свойствами и, тем самым, стимулирует гиперплазию и пролиферацию клеток. Пептид повышает активность симпатоадреналовой системы, увеличивая синтез адреналина и обусловливая высвобождение норадреналина из окончаний симпатических нервов, что стимулирует гипертрофию сердца и сосудов. Ангиотензин II оказывает сильное сосудосуживающее действие, вызывает быстрое и длительное повышение артериального давления. Кроме того, он увеличивает синтез альдостерона, что сопровождается реабсорбцией натрия и воды. В надпочечниках из ангиотензина II образуется ангиотензин III, обладающий положительной инотропной активностью. Далее при участии аминопептидазы N образуется ангиотензин IV, предположительно, участвующий в регуляции гемостаза [31,36,41,54].
Брадикинин - полипептид, состоящий из 9 аминокислот. Брадикинин способен расширять просвет периферических и коронарных сосудов, снижать артериальное давление, способствует синтезу NО в эндотелии. Пептид повышает проницаемость капилляров, сокращает гладкую мускулатуру бронхов и других органов, вызывает болевой эффект. Он стимулирует синтез и освобождение простагландинов и фактора некроза опухолей ( TNFa ) в различных тканях, освобождение ряда интерлейкинов, способствует процессам репарации и обладает инсулиноподобным действием, стимулируя захват глюкозы периферическими тканями, модулирует передачу нервных импульсов в ЦНС и периферической нервной системе, изменяет состояние гематоэнцефалического барьера [13,52,63]. Брадикинин участвует в широком спектре физиологических и патофизиологических эффектов, и особенно в развитии воспаления [52].
Разрушение брадикинина обусловлено наличием в крови и тканях высокоактивных ферментов - кининаз, осуществляющих физиологический контроль уровня кининов. Наиболее важную роль в метаболизме брадикинина играют два фермента - кининаза I (Карбоксипептидаза N), и кининаза II (ангиотензинпревращающий фермент).
1.2 . 3 Ферменты обмена вазоактивных пептидов
АПФ - металлопротеиназа, которая содержит в активном центре ион цинка и активируется ионами Сl-, NO3- ,SO42-, ингибируется соединениями, содержащими SH-группу, хелаторами (ЭДТА, о-фенантролин), брадикининпотенциирующим фактором (K i = 40 нм), 2-меркаптоэтанолом. Кроме того, существуют специфические ингибиторы АПФ - каптоприл (К = 20 нм), лизиноприл (К= 3-10 нм), и эналаприл (К =25-35 нм) [4,20].
рН-Оптимум действия АПФ составляет 7,2-7,6. Препараты АПФ, выделенные из различных органов человека (легких, сердца, печени, мозга, плазмы крови) существенно не различались по следующим физико-химическим параметрам: молекулярной массе, изоэлектрической точке, рН-оптимуму, константе ингибирования известными ингибиторами АПФ. При этом их иммунологические и каталитические свойства могут быть различными [21].
При действии на физиологические субстраты АПФ может вызывать либо превращение неактивной формы в активную, инактивацию биологически активного пептида, либо трансформацию его активности. Так, участвуя в отщеплении С-концевого гистидиллейцина от ангиотензина I, он превращает его в физиологически активный ангиотензин II, инактивирует брадикинин путем последовательного удаления двух С-концевых дипептидов, расщепляет такие функционально активные пептиды, как мет-энкефалин, нейротензин, эндорфин, вещество Р, (действуя в этих превращениях как эндопептидаза), играя роль одного из регулирующих факторов в обмене этих биологически активных веществ [20,36,41]. АПФ принимает участие в процессинге энкефалинов, гидролизуя энкефалинсодержащие пептиды - Met-энкефалин-Arg6-Phe7 в мет-энкефалин и Met-энкефалин- Arg 6-Glu7-Leu8 в Met-энкефалин-Arg6 [4].
АПФ является физиологическим регулятором концентрации в плазме пептида AcSDKP (N-AcSer-Asp-Lys-Pro), влияющего на пролиферацию гемопоэтических и других клеток.
Фермент участвует в регуляции артериального давления. Кроме того, он вовлечен в реализацию таких функций как репродуктивные процессы, защитные и иммунные реакции организма. Участие фермента в том или ином процессе определяется как его локализацией, так и особенностью действия на регуляторные пептиды [20,56]. Являясь фактором, связывающим ККС и РААС - систем, вовлеченных в регуляцию большинства функций организма, реагирует на изменения, возникающие при патологических процессах. В связи с этим представляет интерес изучение активности фермента у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.
1.2.3.2 Карбоксипептидаза N. Карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7. КП N, аргинин-карбоксипептидаза, кининаза I) обнаружена Erdos и соавт. в плазме крови человека в 1962 году. Названа так потому, что по свойствам и специфичности он близок к панкреатической карбоксипептидазе B, но отличается от нее тем, что не имеет неактивного предшественника. Относится к ферментам вневизикулярной локализации - внеклеточной жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран. Фермент локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов, слизистой оболочке носа, моче [13].
Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов: двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88 кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют фермент в плазме крови [61]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных остатков [13,58].
КП N относится к металлокарбоксипептидазам. Активный центр фермента имеет форму кармана, в полости которого находится ион Zn 2+ . В цельной сыворотке крови человека фермент активируется ионами Co 2+ и в меньшей степени Ni 2+ , инактивируется ионами тяжелых металлов, бензоилом-L-аргинином, и хелатными соединениями. Тормозящее действие ингибиторов КП N проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo. При внутривенном введении ингибитора (2-меркаптоэтанол, ЭДТА) усиливалось гипотензивное действие брадикинина. Каталитическая активность фермента оптимальна при pH 7,0 - 7,8, и зависит от природы буферной смеси. В фосфатном буфере максимум активности находится при pH 7,5; в зоне pH 7,0 - 6,0 наблюдается резкое падение активности; в трис-буфере pH - оптимум составляет 7,0. Фермент чувствителен к кислой среде. При pH среды 2,0 - 3,0 он инактивируется необратимо, а при pH 6,5 - 5,0 - обратимо. Трапезникова С.С. и Пасхина Т.С. провели работу по изучению свойств карбоксипептидазы N из сыворотки крови человека, очищенного в 273 раза. Полученные препараты, по данным ультрацентрифугирования, состояли из двух компонентов с константой седиментации 5,3S и 6,5S. Отмечена четко выраженная зависимость фермента от температуры: максимальная активность проявляется при 37°С, при 30°С она снижается наполовину. Лиофилизированные препараты сохраняют свою активность в течение 6 месяцев [4,13].
Помимо способности отщеплять С-концевой аргинин в брадикинине (истинная кининазная активность) и Met 5 -энкефалин-Arg 6 , лизин в Met 5 -энкефалина-Lys 6 , карбоксипептидаза N гидролизует более простые синтетические субстраты: гиппурил-L-аргинин, гиппурил-орнитин (пептидазная активность), а также расщепляет эфиры гиппурил-L-аргининовой кислоты [27]. При этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином. Скорость расщепления гиппурил-аргининовой кислоты в несколько раз выше, чем гиппурил-аргинина. Эстеразная активность фермента угнетается ионами тяжелых металлов, в особенности Cd 2+ , а также аргининовой кислотой и ЭДТА [13].
Биологическая роль КП N во многом остаётся неясной. Инактивируя брадикинин, она способна вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [57,62].
Активность КПN изменяется при воспалительных и аллергических реакциях, так как подкисление реакции среды в тканях будет способствовать накоплению кининов из-за торможения кининазной активности фермента. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [52,63].
Фермент участвует не только в процессинге энкефалинов, но и в их инактивации. Являясь основным ферментом ККС, он участвует в морфогенезе клеток, увеличении проницаемости сосудистой стенки, регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови: гемокоагуляции, фибринолиза, комплемента, развитии злокачественных новообразований [13,52].
Таким образом, КП N вносит вклад в регуляцию многих физиологических процессов и развитие патологических состояний. Поэтому, представляет интерес исследование активности фермента при онкологических заболеваниях в период химиотерапии.
1.3 Функционирование пептидергической системы при онкологических заболеваниях
Злокачественный рост характеризуется изменением активности и спектра ферментов. Ферментный спектр обусловлен локализацией, гистоцитогенезом и степенью дифференцировки опухоли. Если в дифференцированной опухоли ферменты соответствуют таковым данного органа или ткани, то при низкой степени дифференцировки активность и спектр ферментов значительно изменены. Большое значение придается ферментам в инвазии опухолевых клеток. В трансформированных клетках протеиназ синтезируется заметно больше, чем в нормальных клетках. При ряде злокачественных новообразований наблюдается выход пептидаз в межклеточное пространство и увеличение их активности. В сыворотке больных со злокачественными опухолями можно часто обнаружить увеличение активности одних ферментов и уменьшение других. Источником увеличения активности ферментов в сыворотке может являться усиленное выделение его опухолью в кровяное русло. При изучении локализации пептидазной активности в опухолях человека высокая пептидазная активность была выявлена в периферических отделах инвазивно растущих опухолей [19,26,27,41,59].
В процессе онкогенеза участвуют матриксные металлопротеазы (ММП). Транскрипция этих ферментов зависит от целого ряда факторов: цитокинов, факторов роста и некроза опухолей, химических агентов. Участие ММП в опухолевой трансформации, а также в процессах инвазии и метастазирования хорошо доказано in vitro и in vivo. Установлено, что экспрессия ММП коррелирует с деструктивными изменениями в матриксе и с туморогенным фенотипом клеток, а также зависит от вида опухоли и ткани. ММП могут участвовать в процессе канцерогенеза, воздействуя на различные пути передачи сигнала в клетке, основные компоненты соединительнотканного матрикса, на межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные биологически активные молекулы [35]. В опухолевых клетках может образовываться большое количество коллагеназы (представитель семейства ММП), мишенью действия которой является коллаген, представляющий собой барьер для распространения опухолевого процесса. Ингибитор её активности способен ограничивать инвазивность опухолевых клеток. Таким образом, коллагеназы ассоциированы с возникновением метастазирующего фенотипа клеток и играют ключевую роль в процессах инвазии и метастазирования. В процесс неопластической трансформации вовлечены лизосомные цистеиновые протеиназы. Ферменты деградируют многие белки и компоненты внеклеточного матрикса, осуществляют деструкцию ткани. Эти протеиназы осуществляют протеолиз короткоживущих белков, которые регулируют злокачественный рост [29,33,35,55,60].
При раке молочной железы, раке легкого и раке толстой кишки увеличенный уровень коллагеназы типа IV (матриксной металлопротеиназы типа 2, желатиназы A) - один из признаков высокого риска метастазов.
При раке мочевого пузыря повышение уровня коллагеназы типа IV в крови соответствует увеличению массы опухоли [33].
Многие опухоли характеризуются повышенной продукцией коллагеназы I типа, гидролизующей основные компоненты экстрацеллюлярного матрикса и соединительной ткани [35].
Отмечено изменение изоферментного спектра аминопептидазы. При раке легких исчезает изофермент I растворимой аминопептидазы. При злокачественных опухолях печени и желудка появляется новый пик активности фермента [18]. В лейкозных клетках, полученных от больных разными формами лимфопролиферативных заболеваний, обнаружены аминопептидазы по крайней мере двух видов: металло- и SH-зависимые ферменты. В кроветворных клетках была обнаружена аминопептидаза N, главным образом, в популяциях миелоидно-моноцитарного ряда, находящихся на разных стадиях дифференцировки, и рассматривалась как маркер этих клеток. Активность лейцил-аминопептидазы (ЛАП) усиливается в ранние сроки после наступления холестаза (механическая желтуха, вызванная злокачественными новообразованиями). Наибольшее усиление активности фермента при закупорке общего желчного протока опухолью, раке поджелудочной железы [1,8,12]. При новообразованиях печени, наблюдается увеличение активности лейцил-аминопептидазы сыворотки. В меньшей степени активность ЛАП увеличивается при метастатических поражениях печени. У 46 % больных с опухолями описано увеличение активности фермента в моче. Но его исследование не имеет диагностического значения при новообразованиях ротовой полости и области шеи [1,26].
На поздних стадиях рака легких может быть выявлено снижение активности АПФ[47,48].
При раке щитовидной железы (РЩЖ) в ткани (операционный материал) наблюдался значительный рост активности сериновых и цистеиновых протеолитических ферментов. Активность сериновых протеиназ при РЩЖ в 6 раз превышала таковую в контрольной ткани. Активность цистеиновых протеиназ при РЩЖ в 6 раз была выше, чем в контрольной ткани. Это послужило основанием для использования данных показателей как дополнительных критериев РЩЖ [35,39].
У женщин со II стадией злокачественного поражения эндометрия исследовалась пептидгидролазная активность сыворотки крови. Исследования, проведенные в разновозрастных группах доноров, не выявили достоверных изменений в активности изучаемых протеиназ. Активность трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови достоверно увеличивалась у онкобольных женщин и имела тенденцию к увеличению с возрастом. Активность лизосомных катепсиноподобных протеиназ в сыворотке крови онкологических больных в 2,5-2,7 раза выше по сравнению с аналогичными показателями здоровых женщин, что может свидетельствовать об инвазивной стадии данного процесса, который характеризуется нарушением целостности здоровой ткани и стабильности клеточных мембран. С другой стороны данный процесс может сопровождаться усилением биосинтеза изучаемых протеиназ или снижением биосинтеза их эндогенных ингибиторов [19,35].
В облученной опухолевой ткани при раке почки было обнаружено, повышение активности ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ в 4 и 5,5 раз, и снижение ферментативной активности на 74% и 45% для сериновых и цистеиновых протеиназ, соответственно. При сопоставлении активности протеолиза в опухолевой ткани после лучевой терапии и в необлученной опухолевой ткани обнаружено снижение ферментативной активности сериновых и цистеиновых протеиназ. Их активность под влиянием лучевой терапии уменьшалась, составляя всего 7% и 20% от активности до облучения, и после облучения не изменялась, а активность ингибитора цистеиновых протеиназ - увеличивалась в 2 раза [35,59,60].
При злокачественных образованиях толстой кишки активность нейтральных и кислых протеиназ в опухолевой ткани в 1,76 - 2 раза выше, чем в неизмененной ткани кишки. После предоперационного облучения прямой кишки активность протеиназ в облученной опухоли оказывается в 2,8 - 3,58 раза ниже, чем в опухоли не подвергнутой облучению [1,11].
В сыворотке крови онкологических больных (рак легкого, рак молочной железы) исследовали некоторые компоненты калликреин-кининовой системы, а также активность "нейтральных" и "кислых" протеаз и их ингибиторов до и после терапевтического нейтронного облучения. Исследования показали, что предоперационное облучение быстрыми нейтронами на область первичного очага тормозит процессы кининообразования в крови онкологических больных: на 20% снижается уровень калликреина на фоне увеличения содержания неактивного профермента. Общая активность сериновых протеиназ остается неизменной, однако отмечается уменьшение концентрации основного ингибитора калликреина - a 2 -макроглобулина. На этом фоне повышается активность кининоразрушающего фермента карбоксипептидазы N. Вместе с тем, активность "нейтральных" и "кислых" протеаз после облучения имеет четко выраженную тенденцию к уменьшению, а уровень общей антипротеолитической активности остается практически неизменным. При этом отмечается стабилизация состояния клеточных мембран. Между степенью торможения образования протеолитических ферментов и клинически определяемой регрессией размеров опухоли существует достоверная корреляционная зависимость [35,62].
1.4 Роль оксида азота ( II ) в онкогенезе
Оксид азота II обладает мультипотентными свойствами, определяемые как цитотоксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью. При онкологических заболеваниях эта молекула может проявлять и противоопухолевые свойства, и участвовать в патогенезе неоплазий. NO необходим для обеспечения цитотоксического действия макрофагов на опухолевые клетки [23,42]. Выделяемый макрофагами, NO подавляет опухолевые клетки либо блокируя их железосодержащие ферменты, либо повреждая их клеточные структуры. Вызывая повреждение ДНК, NO включается в модуляцию апоптоза: активирует экспрессию p53, который вызывает задержку деления клеток в фазе G1. В то же время p53 по принципу обратной отрицательной связи подавляет синтез iNOS и таким образом предохраняет трансформированные клетки от гибели. Установлено, что синтез iNOS индуцируется TNFa. Уже через 6 - 12 ч. после действия индуктора NO достигает уровня, при котором начинает сказываться его влияние на опухолевые клетки [24,28]. NO участвует в образовании новых сосудов, что необходимо для удовлетворения потребностей раковых клеток в питании. С другой стороны, вследствие этого улучшается доставка оксида азота в опухолевые клетки. NO, выделяемая эндотелиальными или опухолевыми клетками, может стимулировать процесс инвазии в стенку сосуда, поскольку прикрепление к эндотелию сосудов необходимое звено метастазирования. Радикал обладает дезагрергирующим действием. Поэтому следует ожидать, что усиленный синтез NO подавляет межклеточное сцепление клеток в опухоли и облегчает их распространение по организму. Клеткам с минимальной продукцией NO будет труднее отделяться от первичной опухоли и образовывать метастазы. [42].
Таким образом, существуют механизмы поддерживающие баланс между участием NO как в прометастатических, так и в антиопухолевых реакциях [42].
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000 g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента.
Изучение активности ферментов было проведено у 24 мужчин в возрасте от 49 до 70 лет с опухолями легких, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы. Больные подвергались химиотерапевтическому воздействию. Они составили две экспериментальные группы. Первая группа - больные до начала проведения им химиотерапии (12 человек); вторая - те же больные, но после окончания курса лечения (12 человек). В качестве контроля выступала группа из 13 здоровых мужчин такого же возраста.
2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N
Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [61].
Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO 4 , приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37 o C, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37 o C и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.
Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H 2 O.
Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.
2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента
Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37?С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [61]. Пробы колориметрировали на КФК-2 при =590 нм. Активность АПФ определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Концентрацию белка определяли биуретовым методом.
2.2.3 Метод определения содержания белка
Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Принцип метода основан на том, что ионы меди в щелочной среде взаимодействуют с пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации общего белка.
Опытные пробы содержали 50 мкл сыворотки крови и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента (концентрат биуретового реагента развести дистиллированной водой в соотношении 1:19). Контрольные пробы содержали 50 мкл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента. В калибровочную пробу добавляли 50 мкл калибровочного раствора общего белка (раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60 г/л с добавлением хлористого натрия 9 г/л и азида натрия 1 г/л).
Содержимое пробирок тщательно перемешивали, избегая образования пены, инкубировали при комнатной температуре (+ 18 - 25С) в течение 30 минут, после чего измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм.
Концентрацию общего белка рассчитывали, как отношение оптической плотности опытной пробы к оптической плотности калибровочной пробы умноженная на концентрацию общего белка в калибровочном растворе (60 г/л).
2.2.4 Метод к оличественно го определения NO в сыворотке крови
Для определения концентрации NO 0,5 мл сыворотки депротеинизировали добавлением 1 мл 0,5 н. раствора NaOH и 10 % раствора ZnSO 4 для осаждения белковых компонентов. Пробы центрифугировали при 5000 об/мин. 30 мин. К 1мл надосадочной жидкости добавляли равное количество 1 % раствора реактива Грисса и инкубировали в течение 10 мин. при 25С. Затем колориметрировали при 540 нм против контрольной пробы. Содержание NO оценивали по количеству конченого стабильного метаболита оксида азота (II) - нитрит иона. Суммарную концентрацию нитрит-иона определяли колориметрически по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в реактив Грисса. Количество нитрит-иона выражали в мкг на мл.
2.3 Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [16]. Корреляционный анализ проводили с помощью программы «Статистика» (версия 6.0).
3. 1 Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
Результаты исследования показали увеличение активности КПN у онкологических больных в период до проведения химиотерапии по сравнению с контрольной группой в 2 раза, и уменьшение активности фермента после проведения химиотерапии, по отношению к периоду до начала лечения в 2,6 раза (рис.1).
Рис.1. Активность КПN у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=1218; достоверность отличий: * - p< 0,05 относительно контроля, + - p<0,05 относительно до химиотерапии).
Калликреин-кининовая система, к которой относится и КПN играет не только центральную роль в процессах гемокоагуляции и фибринолиза, но и контролирует различные стадии развития злокачественных новообразований [52,63]. Возрастание активности КПN у онкологических больных, вероятно, опосредованно через уменьшение уровня брадикинина может препятствовать высвобождению фактора некроза опухолей (TNFa), способного лизировать большой набор опухолевых клеток in vivo и in vitro. Цитотоксическое действие TNFa на опухолевую клетку связано с деградацией ДНК и нарушением функционирования митохондрий. Таким образом, увеличение активности КПN может способствовать прогрессии опухоли. Снижение активности КПN после химиотерапии до уровня контрольных значений может указывать на существенный противоопухолевый эффект данного терапевтического воздействия. Таким образом, динамическое исследование активности фермента в сыворотке крови больных до и после химиотерапии может быть использовано в качестве дополнительных биохимических критериев при наблюдении за эффективностью проводимого лечения [6,33].
3.2 Исследовани
Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии дипломная работа. Биология и естествознание.
Формы Контроля Реферат
Реферат: Tornadoes Essay Research Paper TornadoesTornadoes could be
Коррозия Металла Лабораторная Работа
Реферат: Печатные излучатели
Угрозы И Вызовы Экономической Безопасности Рф Реферат
Реферат На Тему Роль Общения В Формировании Личности
Курсовая работа по теме Логический синтез цифровых устройств
Методика Технико Экономическое Обоснования
Цена Человеческого Поступка Сочинение По Бедной Лизе
Реферат На Тему Social Interactions And Social Processes
Примеры Курсовика
Защита Программ От Несанкционированного Копирования Реферат
Налоги С Физических Лиц Курсовая
Отчет По Учебной Практике Переводчика
Қазіргі Қазақ Әдебиеті Оның Дамуы Эссе
Реферат по теме Освещенность производственных помещений металлургического производства
Сестринский Уход При Неврозах Реферат
Курсовая работа по теме Предпринимательские отношения в предмете гражданского права
Курсовые Работы На Заказ Таганрог
Реферат: Аграрная политика Н.С. Хрущева. Скачать бесплатно и без регистрации
Причини та наслідки техногенних катастроф - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда контрольная работа
Пожарная обстановка в России - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда реферат
Расчет основных параметров развития пожара в здании завода гелиевого машиностроения - Безопасность жизнедеятельности и охрана труда курсовая работа