A-PVP Кристаллы бесплатные пробы Линц

• • • • • • • • • • • • • • • • •

• • • • • • • • • • • • • • • • •

Гарантии ❗ Качество ❗ Отзывы покупателей ❗

• • • • • • • • • • • • • • • • •

👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇 👇

Наши контакты:

▶️▶️▶️ (НАПИСАТЬ ОПЕРАТОРУ В ТЕЛЕГРАМ)️ ◀️◀️◀️

👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆 👆

• • • • • • • • • • • • • • • • •

🚩 ИСПОЛЬЗУЙТЕ ВПН (VPN), ЕСЛИ ССЫЛКА НЕ ОТКРЫВАЕТСЯ!

🚩 В Телеграм переходить только по ссылке что выше! В поиске тг фейки!

• • • • • • • • • • • • • • • • •

A-PVP Кристаллы бесплатные пробы Линц

В настоящем документе описывается идентификация льда-связывающих белков с замораживанием терпимо растений путем оценки ингибирования активности льда рекристаллизации и последующего выделение нативных PIL, используя очистку льда сродства. Ice-связывающие белки PIL, принадлежат к семейству индуцированных стрессом белков, которые синтезируются с помощью некоторых организмов, подвергшихся воздействию отрицательных температур. В растениях, повреждение замораживания происходит, когда внеклеточные кристаллы льда растет, что приводит к разрыву плазматической мембраны и возможной гибели клеток. Адсорбция PIL, чтобы кристаллов льда ограничивает дальнейший рост с помощью процесса, известного как лед рекристаллизации торможения IRI , тем самым уменьшая повреждение клеток. PIL, также демонстрирует способность угнетает температуру замерзания раствора ниже точки плавления равновесия, свойство известного как тепловая гистерезиса TH активность. Эти защитные свойства повысили интерес к идентификации новых PIL, из-за их возможное использование в промышленных, медицинских и сельскохозяйственных применениях. После индуцирования ИБФ при воздействии низкой температуры экстракты испытывают на активность IRI с использованием «анализа splat», который позволяет наблюдать рост кристаллов льда с использованием стандартного светового микроскопа. Этот анализ требует низкой концентрации белка и генерирует результаты, которые быстро получены и легко интерпретируются, обеспечивая начальный экран для активности связывания льда. Затем ИБП могут быть выделены из загрязняющих белков, используя свойство ИБФ для адсорбции на льду, с помощью методики, называемой «аффинная очистка льдом». Используя клеточные лизаты, собранные из растительных экстрактов, можно медленно выращивать ледяное полушарие на латунном зонде. Это включает IBPs в кристаллическую структуру поликристаллического льда. Не требуя априорных биохимических или структурных знаний о ИБФ, этот метод позволяет восстановить активный белок. Очищенные от льда белковые фракции могут быть использованы для нижестоящих применений, включая идентификацию pepприлив последовательности по масс-спектрометрии и биохимического анализа нативных белков. Ice-связывающие белки PIL , представляют собой разнородное семейство защитных белков , которые были обнаружены в ряде организмов , в том числе и растения, насекомых-2, 3, рыб и микробов 4. Ключевой особенностью этих белков является их уникальная способность специфически и эффективно адсорбироваться кристаллов льда, изменяя их рост. PIL, имеют несколько документированных свойств, с двумя наиболее хорошо охарактеризованных будучи тепловой гистерезис TH и ингибирование льда рекристаллизации IRI. TH активность более легко наблюдать в PIL, произведенных в замораживающих непереносимостью животных. Результаты этой деятельности в снижении точки замерзания кровеносной или интерстициальных жидкостей организмов для предотвращения замерзания. В противоположность этому, в морозильных толерантных организмов, которые неизбежно будут замерзать при отрицательных температурах, PIL, по всей видимости, обладают низкой активностью TH. Несмотря на низкой активности TH, высокая активность IRI ограничить лед крикStal рост часто наблюдается с этими белками. Для сублимационной терпимы организма, эта деятельность IRI предположительно помогает защитить клетки от неконтролируемого роста льда в внеклеточных отсеках. Модель «Кнопка Матрас» может быть использован для описания механизма , с помощью которого PIL , предотвратить рост кристаллов льда 5. В соответствии с этой моделью, PIL, специфически адсорбироваться на поверхности кристаллов льда с интервалами, таким образом, что молекулы воды могут только включают с ростом кристаллов льда решетки в пространстве между связанной PIL,. Это создает кривизну , что делает включение дополнительных молекул воды неблагоприятно, событие , которое может быть описано с помощью эффекта Гиббса-Томсон 6. TH активность может быть определена количественно путем измерения разности между плавления и замораживания температуры одного ледяного кристалла в присутствии IBP. В то время как активность TH является широко распространенным методом оценки активности, PIL, низкого зазора TH производимого заводом PIL, как правило, лишь доли градуса обычно требует высокой концентрации белка, специализированного оборудования и опыта оператора. Методология, используемая для проверки этой активности известен как «знак» анализа, в результате чего образец белка флэш заморожены для получения монослой мелких кристаллов льда, которые наблюдаются в течение определенного периода времени, чтобы определить, является лиРост кристаллов льда ограничен. В отличие от других методов, используемых для скрининга образца источника ткани на наличие PIL, этот метод применим к низкой концентрации белка в диапазоне нг, использует легко панельном оборудование, и генерирует данные, которые быстро и легко интерпретировать. Тем не менее, важно подчеркнуть, что этот анализ обеспечивает начальный экран для PIL, которым необходимо следовать путем определения TH и формирования кристаллов льда. Выделение нативных белков является сложной задачей, часто требует информации о структурных и биохимических свойств белка. Сродство PIL, для льда позволяет для выделения этих белков с использованием льда в качестве субстрата для целей очистки. Поскольку большинство молекул выталкиваются вперед границы льда-воды в процессе роста кристаллов льда, медленный рост ледяной полусферы в присутствии результатов выборки IBP в высоко очищенной пробе, лишенный большого quantitх года примесных белков и растворенные вещества. Этот метод был использован для идентификации PIL , от насекомых 8, 9, 10, 11 бактерий, рыб и растений 12 13, Кроме того, IBP-обогащенные фракции, полученные с помощью этого метода можно также использовать для нисходящего биохимического анализа. В настоящем документе описывается идентификацией PIL, в растениях путем индукции и извлечения PIL, анализ активности IRI, чтобы подтвердить наличие белков, а также выделение белков с помощью аффинной очистки льда. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Для простоты установки, рис 1 и На рисунке 2, включены в качестве визуальных представлений оборудования , используемого для анализа IRI и очистки льда сродства, соответственно. Эти результаты показывают, что экстракты, полученные из горчицы сорняков, которое не замерзает толерантным, не смогло ограничить рост кристаллов льда из-за отсутствие PIL, настоящее время. В отличие от этого, мелкие кристаллы льда видели с трансгенные растения, содержащие PIL, райграса пастбищного ограничивают рост кристаллов льда существенно. На рисунке 4 показаны льда полушарий , выращенных с использованием экстрактов райграса пастбищного , экспрессирующие PIL , после двух раундов очистки. После первого раунда очистки высокой степени льда травления на hemispheповторно поверхность указывает на то, что PIL , которые адсорбируют на льду и модифицированного роста кристаллов льда фиг. Второй раунд очистки показан на фиг. Лед-травления на поверхности полусферы указывает, что PIL, все еще присутствуют. На фиг. Ряд белков были идентифицированы с семью различными группами, соответствующих наиболее распространенных белков, которые адсорбируют на лед. Рисунок 1: Схематическое представление устройства 16 знака. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: Устройство используется для очистки ото льда сродства PIL , Духовой «ледяной палец» присоединенный к программируемому этиленгликоля ванны используют медленно расти со льдом полушарие. Монослой кристаллов льда формируется с использованием растительных экстрактов, визуализируется при кратном увеличении. В отличие от этого , рост кристаллов льда был ограничен в А. Рисунок 4: Ice-полусфера , выращенное с использованием IBP экстрактов , собранные из лиофильно терпимы трав, L. После того, как экстракты трав были подвергнуты один раунд очистки льда сродства, лед-травление поверхности льда полушарии указывает на успешное включение PIL , A. Чтобы удалить дополнительные растворенные вещества, пигменты и примесные белки, был использован второй раунд ледяного сродства, что приводит к четкому льду полушария B. Рисунок 5: Мониторинг очистки нативных PIL , райграса пастбищного. После двух раундов очистки льда сродства и центробежной концентрации,нативные экстракты трав подвергали электрофорезу на денатурирующем полиакриламидном геле SDS-PAGE , а затем визуализируют с использованием серебра пятно. Дорожка 1: молекулярная масса белка лестницы; Дорожка 2: в неразбавленном виде экстракта; Дорожка образцы, разбавленные в воде до загрузки гель с соотношением 1: 2, 5 и пробы воды. Так как этот конкретный вид растений содержит ряд PIL, множественные полосы, наблюдаемые, которые могут соответствовать различному изоформу IBP. Для успешного анализа и очистки PIL, важно понимать, чувствительная к температуре характера некоторых из этих белков. Другой фактор, который следует учитывать при использовании целых клеток сырых лизатов является деградацией белков эндогенных протеаза. В растениях, экспрессия PIL, как правило, низок, и, следовательно, любые потери, выход белка может привести к недостаточному материала для будущих экспериментов или анализа. Работа быстро при экстракции белка, с добавлением надежного ингибиторов протеаз может уменьшить такие потери белка. Кроме того, важно, что период холодной акклиматизации быть оптимизирован для наибольшего накопления PIL, в лаборатории, выращеннойрастения. Другая распространенная проблема при работе с PIL, что многие из анализов чувствительны к температуре и влажности. В отношении анализа IRI, накопление влаги на крышке стекло микроскопа может привести слоем льда, что делает визуализацию кристаллов льда трудно. Анализ знак, как представлено, качественно. Выполняя серию разбавления перед проведением анализа, конечная точка МРИ может быть установлена, чтобы определить диапазон концентраций, в котором PIL, больше не может ограничивать рост кристаллов льда. Различные лаборатории также использовали компьютерное программное обеспечение для измерения среднего размера зерен кристаллов льда Как было указано выше, при тестировании на активность IRI является эффективным начальным экраном, подтверждением лед связываниядеятельность должна быть установлена путем определения уровня TH или непосредственно визуализировать адсорбцию PIL , к кристаллам льда Эти молекулы могут включать в себя объемные белки, фенольные гликозиды, и синтетические полимеры , такие как поливиниловый спирт 19, 20, В результате, управление буфером всегда должен быть запущен с образцами, чтобы гарантировать, что любые примеси или добавки не приводят к наблюдаемой активности IRI. В то время очистки льда сродством легко выполняется, если не сделано правильно, другие белки, растворенные вещества и метаболиты могут преобладающими. Важным фактором является скорость роста кристаллов льда; за счет снижения скорости охлаждения то есть Как указывалось ранее, несколько раундов сродства со льдом могут также уточнить лед-фракцию и результат в пробе более высокой чистоты. Следует отметить, что вторичные метаболиты часто избыточном под биотическими и абиотическими условиями стресса у растений. Антиоксидантные добавки , такие как тиомочевины мМ также может быть использован 19, Если информация о IBP интересе известна, дополнительные стадии очистки, таких как литий высокого давленияфунтов хроматография ВЭЖХ , также могут быть использованы. Модификации очистки льда сродства могут быть также рассмотрены и были зарегистрированы , чтобы оптимизировать выход белка и получить дополнительное понимание характеристик IBP включая более быстрой очистки льда оболочки 23 и флуоресценции на основе льда плоскости сродства FIPA После оптимизации, методы, описанные выше, могут давать очищенный пул белка для идентификации PIL,; однако, неспецифические включение других весьма распространенных белков может быть неизбежным. В то время как PIL , из семейства мятликового имеют гомологичные последовательности 25, в связи с большим разнообразием между PIL , из различных организмов, то , как правило , не представляется возможным идентифицировать IBP по гомологии последовательностей в одиночку. Общей чертой PIL , является наличие аминокислот , известных для связывания льда, включая треонин, серин и валин 26; идентификации пептидов последовательности богаты гоESE остатки могут быть полезны при добыче Секенс Дата. Bredow, M. To learn more about our GDPR policies click here. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions jove. Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login. You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free. To get started, a verification email has been sent to email institution. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your 'Spam' folder. Your access has now expired. Provide feedback to your librarian. If you have any questions, please do not hesitate to reach out to our customer success team. Login processing JoVE Journal Biochemistry. Настройка устройства 1. Примечание: Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован. Чтобы собрать внешнюю камеру, использовать изолированный пластиковые трубы, чтобы прикрепить ванну воды в стеклянную емкость с двойными стенками. Изолируйте стеклянный шар с пенополистиролом и крышка с пластиковой крышкой чашки Петри. Вырезать дюйма отверстие в нижней части камеры полистирола, так что источник света можно увидеть через стеклянную камеру. Установите внешнюю камеру на рассечение микроскоп, снабженный портом камеры и 4X поляризованной линзы объектива с кратным хрусталика. Поместите дополнительный кусок поляризованной пленки в нижней части внешней камеры. Это не относится к образцам, собранных с поля, которые уже подверглись воздействию низких температурных условий и сроков акклиматизации. Получают примерно 0,1 г ткани листьев путем разрезания у основания стебля, а затем поместить в 1,5 мл трубки. Для того, чтобы лизировать клетки, измельчить образец ткани в мелкий порошок с помощью ступки и пестика в присутствии жидкого азота. Убедитесь, что жидкий азот не испаряется в процессе гомогенизации. Сразу же место пробы грунта на лед и позволяют жидкий азот полностью испарился. Пипетка для смешивания; не вихрь. Примечание: Дополнительные добавки, возможно, должны быть использованы, если лизат содержит вторичные метаболиты см Обсуждения. Сохранить растворимую фракцию и центрифуги в течение еще 5 мин, если клеточный дебрис сохраняется. Анализ Splat Предварительный эксперимент Настройка Налейте мл гексана во внешнюю камеру, созданной с поляризованной пленкой и добавить десикацию шарики, чтобы предотвратить попадание влаги накапливаться на слайдах. Добавьте небольшое количество вакуумной смазки на пластины, закрывающей ванну и крутить, чтобы обеспечить герметичное уплотнение и предотвратить испарение гексана. Перед началом эксперимента обязательно проверьте температуру гексана с помощью термометра. Поместите охлаждающий блок в полистироловую коробку непосредственно под пластиковую трубку и закройте полностью сухим льдом за 40 минут до начала эксперимента. Перед началом анализа убедитесь, что трубка ровная. Чтобы определить, где на охлаждающем блоке будет падать образец, сначала проверьте процедуру с водой и укажите, где образец падает с помощью маркера как описано ниже. Удалите сухой лед с верхней части холодного блока и поместите крышку стекла микроскопа слайд на метку капли, которая была определена с водой. Непосредственно перед началом анализа включите источник света и очистите лед, образовавшийся на дне стеклянной камеры. Избегайте держать источник света включенным, если не кристаллы льдав настоящее время визуализируется, чтобы предотвратить нагревание гексана. Проведение анализе Splat Окуните одноразовый наконечник, прикрепленный к автоматической пипетки мкл в иммерсионного масла, используя бумажное полотенце удалить излишки масла. Этот шаг позволит образец падать, а не придерживаться внешней пипетки. Примечание: Удаление избытка масла из пипетки имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы капли масла не образуются на кристаллах льда, что делает визуализацию трудно. Пипетка 10 мкл образца и поместить пипеткой непосредственно над пластиковой трубки перед выпуском образца. Отдельный «знак» звук должен быть услышан, когда образец попадет в стекле крышку слайд, создавая монослой кристаллов льда. Быстро и осторожно снять стекло микроскопа с холодной блока с помощью пинцета и место в гексане ванны на верхней части поляризационной пленки. Глядя под микроскопом, поставить стекло микроскопа в поле зрения и объявленияпросто линза объектива, так что кросс-поляризация позволяет для визуализации высокого контраста кристаллов льда. Отрегулировать увеличение до 40x. Установите камеру к микроскопу и настроить параметры на «макро», чтобы позволить четкую визуализацию кристаллов льда и захвату изображения. Повторите шаги 4. Как правило, размещать до 6 слайдов с различным образцом в камере гексан. Выключите источник света и поместите пластиковую пластину над гексаном ванной, что обеспечивает герметичное уплотнение. Разрешить кристаллы льда отжечь в течение ночи ч, поддерживая постоянный период отжига в пределах конкретного анализа. После инкубации захвата изображения ледяных пленок, как описано выше. Примечание: Некоторые образцы могут рекристаллизации быстрее, чем другие. Если нет рекристаллизации не видно через 12 ч, кристаллы позволяют отжечь до 24 ч, чтобы гарантировать, что не recrystalliзация будет происходить. Анализ 5. Анализ данных Splat Загрузить фотографии на компьютер и непосредственно сравнить размер кристаллов льда до и после отжига. Образцы с активностью льда рекристаллизации не будет расти, тогда как образцы без IRI не будет активности рекристаллизации формированию заметно более крупные кристаллы льда. Свет помехи сделают крупные кристаллы льда появляются в нескольких различных оттенках и, таким образом, легко видеть. Ice сродством Установка очистки оборудования Заполните температурно-программируемой ванны, циркулирующей воды с этиленгликолем. Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован. Подключите ванну к полой, латуни зонду с использованием изолированных пластиковых трубок Построить полистирол контейнер, в котором мл химического стакан может поместиться ожидающим. Создайте крышку для контейнера с отверстием в центре для духового хладопроводе. Приготовление образцов для льда-аффинной очистки Холодное акклиматизироваться растительной ткани, как описано в разделе 2. Подготовка образца, как описано в разделах 2. Используйте соотношение 1: 1 мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка для взмучивания листовой ткани. Используйте дополнительные таблетки ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации PIL, эндогенных протеаз. Примечание: Если образец ткани слишком концентрированный, регулировать соотношение до 1: 2 или 1: 3 мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка. Для того, чтобы удалить остатки клеток, сито лизата через 2 слоя марли, 3 раза. Увеличение объема образца до мл с использованием нативного буфера для экстракции белка. Используйте лизат немедленно для очистки льда сродства кВо избежание какой-либо потери льда-связывающей активности. Проведение ледово-аффинной очистки До начала очистки, установить ванну программируемую воды для охлаждения от Примечание: Скорость охлаждения может быть скорректирована в зависимости от начального объема образца. Добавьте несколько кусочков льда для облегчения льда зарождение и позволяют тонким слоем льда, образуя на пальце. Этот процесс обычно занимает от 20 до 30 мин. Если слой льда не образуется при Поместите образец в стеклянном стакане объем мл, содержащий небольшую магнитную мешалку в полистирольном контейнер на верхней часть магнитной мешалки. Убедитесь в том, что лед палецпо центру и опускается по меньшей мере, на полпути в жидкой пробе. Печать контейнера. Позволяет программе работать в течение примерно двух дней, проверяя каждые 24 часа. Включение PIL, в ледяном полушарие приведет к «льду травлению». Примечание: Очистные эксперименты можно сделать с использованием больших объемов образцов с длиной времени, в котором работает программа скорректированной соответствующим образом. Если ледяная полусфера все еще содержитс пигментом, или для увеличения очистки образца, повторите шаги 8. Примечание: Хотя концентрация IBP может быть ниже после нескольких раундов очистки, чистота является более ценным, чем выход, если очищенные образцы будут проанализированы с помощью MS. Если достаточное количество материала доступно, рекомендуются три раунда очистки льда сродства. Перед отправкой образцов для MS, определяет концентрацию белка с помощью количественного анализа белка, таких как BCA или Бредфорд. Тест очищенных белков для активности IRI до сутиnding для MS, чтобы гарантировать, что активный белок был сохранен за счет стадий очистки и концентрации. Использование концентрированных образцов непосредственно для масс - спектрометрического анализа Play Video. Cite this Article Bredow, M. Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account. Continue with Shibboleth or Forgot Password? Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. You might already have access to this content! Please enter your Institution or Company email below to check. Please enter an institutional email address. Check access. Create Account. Forgot Password? Reset Password. Phone number. Request trial. Thank You! A JoVE representative will be in touch with you shortly. Waiting for verification email? Please click here to activate your free 2-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin. Enable Javascript for audio controls. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. We use cookies to enhance your experience on our website. Continue Learn more Close. Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store i. Home Depot.

Купить Кокаин Анапа