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对于高GC的扩增子，可提高退火延伸温度至65℃；循环数设置为40-45可满足绝大多数的反应；对于Tm较低的引物，可使用三步法，比如退火温度设置在55℃，延伸温度设置为72℃，信号采集设置在延伸步骤。
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